ستون HPLC قلب این دستگاه است و باید در نظر داشت که این قلب بسیار ظریف و حساس است. ما وظیفه داریم برای حفظ عملکرد بهینه از آن محافظت کنیم. به عنوان یک وسیله‌ی کاربردی طی سالیان زیاد، همه نوع شایعه‌ای درباره‌ی ستون‌ها مطرح شده است. به خصوص در مورد بازسازی یک ستون، حرف‌های بسیاری مطرح است. در این مطلب قصد داریم اندکی به موضوع بازسازی ستون‌ها بپردازیم. با ما همراه باشید.
نخست بیایید به دو دسته‌ی اصلی از آسیب‌ها که در هنگام استفاده از ستون HPLC رخ می‌دهد بپردازیم:
- آسیب‌های فیزیکی
- آسیب‌های شیمیایی
آسیب فیزیکی
هرچند این حالت شامل تهی‌گاه‌ها و درزها است؛ در ستون‌های مدرن نادر بوده و رایج‌ترین مشکلی که مشاهده می‌کنیم انسداد فیزیکی در بالای ستون است که خمیر شیشه یا حجم خلل و فرج پکینگ به واسطه آلودگی ذره‌ای مسدود می‌شود. این امر به افزایش فشار برگشتی می‌انجامد.
آسیب شیمیایی
این حالت خودش دو نوع دارد:
- آسیب مستقیم؛ مانند حذف یا تغییر شیمیایی دائمی لیگاند فاز ایستا.
- آسیب غیرمستقیم؛ که در آن آلودگی به صورت دائمی با فاز ایستا همراه شده و گزینش‌پذیری ستون را تغییر می‌دهد.
این نوع مشکل به کاهش عملکرد ستون، معمولا به شکل قله‌ی ضعیف (دنباله‌دار، پیش‌دار یا fronting، صندلی‌شکل یا تفکیک‌شده)، کاهش رزولوشن و تغییر در زمان بازداری منجر می‌شود. این وضعیت اغلب بدون افزایش چشم‌گیر در فشار برگشتی رخ می‌دهد.
آیا می‌توان این مشکل را حل کرد؟
اگر عملکرد ستون به سطح چشم‌گیری تنزل یافته باشد، پاسخ (تقریبا همیشه) خیر است. اما اگر قبلا از خیر ستون خود گذشته‌اید، انجام اقدامات زیر ضرری ندارد. ضمنا در صورت نیاز به تهیه ستون HPLC از صدراپژوهش به صفحه‌ی خرید ستون HPLC وارد شوید.
- معکوس کردن ستون
اگر یک ستون غیرقابل استفاده شده باشد، معکوس کردن ستون ارزش امتحان کردن دارد؛ به ویژه با ستون‌هایی که فشار برگشتی زیادی نشان می‌دهند. ستون‌های مدرن در به‌کارگیری به صورت معکوس تحمل بالاتری دارند هرچند هنوز این ریسک وجود دارد که معکوس‌کردن سبب آسیب دائمی شود. اگر قصد دارید ستون را به هر شکلی از بین ببرید، ارزش امتحان کردن خواهد داشت. - شست‌وشوی ستون با یک شوینده‌ی آلی قوی برای یک مدت طولانی
این کار معمولا به معنی سوییچ‌کردن ستون به یک گرادیان آب : استونیتریل است. با غلظت بالای آب (مثلا 90%) شروع به حذف هرگونه بافر باقیمانده کنید که ممکن است در مواد بسیار آلی نفوذ کند. گرادیان را تا 100% استونیتریل افزایش دهید و به مدت چند ساعت نگه دارید. بسیاری از کاربران نسبت به استفاده از مواد 100% آلی در ستون‌های خود بی‌میل هستند. - چندین تزریق حجیم از دی‌متیل‌سولفوکسید (DMSO) (مثلا 100uL) انجام دهید.
10 نکته برای محافظت از ستون
در نظر داشته باشید که تلاش برای استفاده‌ی بهتر و جلوگیری از آسیب، خیلی بهتر از اقدام به تعمیر است. این موضوع هم در مورد قطعات و هم در مورد تمام تجهیزات آزمایشگاهی صادق است. بهتر است هنگام کار سیستم بر عملکرد آن نظارت داشته باشید (به جای وضعیت اجرا/عدم اجرا، شرایط را قرائت و ثبت کنید) و از ابتدای بروز مشکل مداخله نمایید.
10 نکته برای محافظت ستون عبارتند از:
- از یک گرادیان بهره بگیرید که تا 100% ماده آلی افزایش می‌یابد. هرچند این کار به بافر فاز متحرک شما بستگی دارد، یکی از بهترین تاکتیک‌ها در محافظت از ستون است. این کار آلودگی شیمیایی در هر تزریق را رفع کرده و از انباشت که به آسیب دائمی منجر می‌شود، جلوگیری می‌کند. (مقاله‌ی تفاوت روش ایزوکراتیک و گرادیان در HPLC را در بلاگ صدراپژوهش مطالعه نموده‌اید؟)
- در تهیه‌ی نمونه‌ی خود دقت کنید. نمونه‌های حاوی اجزای خطرناک که از حداقل آماده‌سازی نمونه‌ای برخوردارند، خطر زیادی را برای ستون ایجاد می‌کنند. تهیه‌ی نمونه‌ی پیچیده‌تر (مثلا SPE) می‌تواند هزینه و زمان را تا حد زیادی افزایش دهد؛ در حالی که کاهش پایداری و قابلیت کمی‌سازی را به همراه دارد. در بسیاری از موارد، هزینه‌های مربوط به نرخ فرسایش بالای ستون از هزینه‌ی آماده‌سازی پیچیده بسیار کمتر است.
- شست‌وشوی پرفشار (flush). اگر اعتبارسنجی به شما اجازه اصلاح پروفایل گرادیان به یک مقدار ماده‌ی آلی بیشتر را نمی‌دهد، می‌توانید از یک شستشوی پرفشار با مقدار زیادی ماده‌ی آلی استفاده کنید. این کار می‌تواند پس از تکرار آزمایش‌ها یا در چند نقطه در حین آن‌ها باشد. به این ترتیب از خطوط اضافی موجود در سیستم‌های فاز متحرک چهارتایی به خوبی استفاده می‌شود، فرایند خودکار بوده و می‌تواند بهبود زیادی در طول عمر ستون ایجاد کند.
- نمونه‌ی خود را تا حد ممکن رقیق کنید. این کار سبب رقیق‌شدن آلودگی شده و بار روی ستون را کاهش می‌دهد. این کار به ویژه برای مواد نیمه‌جامد از قبیل ژل‌ها که نمی‌توان آن‌ها را فیلتر کرد و حذف آن‌ها از طریق آماده‌سازی نمونه دشوار است، اهمیت دارد.
- در صورت نیاز، روش‌های مختلف آشکارسازی را برای افزایش حساسیت مد نظر قرار دهید که به شما اجازه دهد مقدار نمونه‌ی کمتری را به کار برید.
- میزان pH ستون خود را بررسی کنید. به جز موارد بیان شده، ستون‌های سیلیکایی برای استفاده در فازهای متحرک بین pH 2-8 مجاز هستند.
- اگر شاهد افزایش فشار ستون خود هستید، احتمالا به دلیل ذرات است و شانس خوبی وجود دارد که آن‌ها را با فیلترکردن حذف کنید. ابتدا یک فیلتر داخلی بین نمونه‌گیر خودکار و ستون را امتحان کنید اما اگر جواب نداد، فیلترکردن نمونه‌ها با استفاده از یک فیلتر غشایی با حفره کوچک (2µm) با شیمی مناسب را بیازمایید.
- از یک ستون با اندازه‌ی ذره‌ی بزرگتر استفاده کنید. آن‌ها نسبت به آلودگی ذره‌ای و شیمیایی مقاوم‌تر هستند.
- از یک ستون محافظ استفاده کنید. محصولات جدیدتر هیچ تاثیر بدی روی بازده ندارند. هرچند ممکن است گران باشند.
- فاز متحرک خود را فیلتر کنید. باید برای همه فازهای متحرک این کار را انجام دهید اما این کار برای ستون‌های دارای اندازه ذره‌ی کوچک‌تر، اهمیت ویژه‌ای دارد.
برای اطلاع از موجودی و خرید ستون HPLC کلیک کنید.
