ستون ZORBAX
در آزمایشگاههای دارویی سالهاست که ستونهای ZORBAX بهعنوان ابزار اصلی در جداسازیهای دشوار بهکار میروند. به جرات میتوان گفت که ماندگاری آنها در بازار اتفاقی نبوده است. شرکت Agilent بهطور مستمر این خانواده را توسعه داده تا مجموعهای از فازهای شیمیایی، اندازه ذرات و ساختارهای منفذی را پوشش دهد که پژوهشگران در توسعهی روش (Method Development)، هنگام جابهجایی میان آنالیز مولکولهای کوچک، نقشهبرداری پپتیدی و جداسازی پروتئینهای دستنخورده واقعاً به آن نیاز دارند. برای تیمهایی که آزمونهای تحت مقررات (Regulated) را اجرا میکنند، این مجموعه تضمینکنندهی تکرارپذیری بین بچها و قابلیت رهگیری کامل (Full Traceability) است. این ویژگیها دقیقا همانهایی هستند که منجر میشوند یک Method برای دههها بدون هیچ تغییری در سرویس باقی بماند. در واقع، وجود این ویژگیها امری الزامیست.
خانوادههای اصلی در ZORBAX
در طول سالها، ما بیشتر فازهای ZORBAX را بهطور موازی بهکار گرفتهایم تا گلوگاههای خاص در توسعهی روش را برطرف کنیم. این موضوع شامل موارد زیر میشود:
- Eclipse Plus: این نوع نقطهی شروع و پیشفرض ما در توسعهی روش برای مولکولهای کوچک است. شیمی سطحی این ستون بهطور مداوم شکل پیک تمیزتری برای ترکیبات بازی فراهم میکند، بهویژه زمانی که در pH خنثی با بافرهای فرمات آمونیوم (Ammonium Formate) یا استات (Acetate) کار میکنیم. زمانی که سازگاری با MS حیاتی باشد، انتخابی کاملاً عملی محسوب میشود.
- StableBond (SB): زمانی که آزمونها باید در pH = 1–2 با مدیفایرهای تریفلوئورواستیک اسید (trifluoroacetic acid) یا فرمیک اسید (Formic Acid) اجرا شوند، ستون StableBond در شرایطی پایدار میماند که سایر ستونها بهسرعت دچار افت کارایی میشوند. ما بارها هضمهای پپتیدی را در دماهای 80 تا 90 درجهی سانتیگراد روی SB-C18 اجرا کردهایم بدون آنکه افت محسوسی در عملکرد مشاهده کنیم.
- Extend-C18: راهحلی مطمئن برای جداسازیهای با pH بالا. ما معمولا از این ستون همراه با فازهای متحرک حاوی 20–50 mM هیدروکسید آمونیوم (Ammonium Hydroxide) تا pH = 10.5 برای جداسازی APIهای بازی در حالت Free-Base استفاده کردهایم و طول عمر ستون تحت این شرایط بسیار رضایتبخش بوده است.
- Bonus-RP: گروه قطبی تعبیهشده در این ستون ترتیب نگهداری ترکیبات را بهطرز مفیدی تغییر میدهد. بهعنوان نمونه، ما متابولیتهایی را که همیشه در ستونهای C18 مرسوم به صورت همزمان شسته میشدند، با Bonus-RP بهخوبی از هم جدا کردهایم.
- Eclipse PAH: اصولا این ستون برای آزمایشگاههای محیطزیست خیلی کاربرد دارد. انتخابپذیری (Selectivity) آن برای ترکیبات آروماتیک چندحلقهای زمان جداسازی پنلهای استاندارد EPA PAH را بهشکل محسوسی کوتاه میکند.
- XDB Series: فناوری XDB (کوتاهشدهی Extra Dense Bonding) باعث افزایش طول عمر روشها در محیطهای QC شده است، بهویژه زمانی که ترکیب فاز متحرک بین بچها متغیر باشد.
- HILIC Plus: این مدل مناسب آنالیتهای قطبی است که روی سیستمهای Reversed-Phase نگهداری نمیشوند. ما عملکرد بسیار خوبی در جداسازی نوکلئوتیدهای کوچک و آفتکشهای قطبی با استفاده از 80-90% Acetonitrile و بافرهای آبی کمنمک دیدهایم.
- 300SB Series: با منافذ 300 Å، این ستونها برای بیومولکولها ضروری هستند. در نقشهبرداری پپتیدی از mAbs، ستون 300SB-C18 پوشش توالی یکنواختی را بدون دنبالهدارشدن بیش از حد (که معمولا در ذرات با منافذ کوچکتر دیده میشود) فراهم کرده است.
- PrepHT: شیمی شناختهشده در آنالیزهای تحلیلی را برای تخلیص نیمهPreparative مقیاسدهی میکند. ما بارها شاهد انتقال از ستون 6 mm Eclipse Plus به ستون 21.2 mm PrepHT بودهایم. این جابهجایی تنها با تنظیمات ساده در بارگذاری انجام شده است.
اندازه ذرات و گزینههای کارایی
پرتفوی ZORBAX دامنهای از ذرات متداول 5 µm، ذرات میانی 3.5 µm و تا ذرات ریز 1.8 µm را شامل میشود. ذرات 1.8 µm در دو فرمت سختافزاری عرضه میشوند:
- RRHT (Rapid Resolution High Throughput): طراحیشده برای دستگاههایی با محدودیت فشار حدود 600 bar.
- RRHD (Rapid Resolution High Definition): مناسب برای سیستمهایی مانند Agilent 1290 Infinity II با پایداری تا 1200 bar.
در عمل، ما از RRHD زمانی استفاده میکنیم که جداسازی ناخالصیهای بسیار نزدیک غیرقابل مصالحه باشد یا وقتی برای کوانتیتاسیون در LC–MS به پیکهای باریک نیاز داریم. در مقابل، RRHT همچنان جایگاه خود را در غربالگریهای پرحجم حفظ کرده است، جایی که محدودیت فشار دستگاه پایینتر است.
راهنمای توسعهی روش (Method Development)
برای بیشتر آزمونهای جدید، ابتدا کار را با یک فاز C18 آغاز میکنیم – معمولا Eclipse Plus و در صورت نیاز به سرعت بالا، Poroshell EC-C18.
اگر نگهداری (Retention) برای ترکیبات آبگریزی که دیرشوینده هستند (late-eluting hydrophobics) بیش از حد قوی باشد، فازهای C8 یا phenyl-hexyl گزینهای متعادلتر ارائه میدهند. در شرایط pH پایین، ستونهای SB-C18 و SB-Aq از نظر پایداری بیرقیب هستند، در حالی که در pH قلیایی، ستون Extend-C18 طول عمر صدها تزریق را تحت شرایط سخت به ما ارائه میدهد.
در مرحلهی غربالگری، معمولا مجموعهای از فازهای Bonus-RP و CN را در دسترس نگه میداریم. هر دوی اینها، انتخابپذیری ارتوگونال (orthogonal) فراهم میکنند و همین سرمایهگذاری کوچک در اجرای تستهای شناسایی، زمان زیادی را در پروژههایی که تحت فشار زمانبندیهای نظارتی هستند برایمان ذخیره میکند. برای پپتیدها، به ندرت از ستونهای با منفذ پهن (300 Å) صرفنظر میکنیم؛ تلاش برای اجرای آنها روی بسترهای 100 Å اشتباهی است که فقط یک بار مرتکب میشوید.
حوزههای کاربرد
ستونهای ZORBAX کارایی خود را در طیف وسیعی از صنایع اثبات کردهاند:
- Pharma: پروفایلینگ ناخالصیها، روشهای نشانگر پایداری و شناسایی متابولیتها.
- Biopharma: نقشهبرداری پپتیدی از مونوکلونال آنتیبادیها و جداسازی پروتئینهای دستنخورده (intact protein).
- Environmental: غربالگری PAH و آفتکشها تحت پروتکلهای EPA و اتحادیهی اروپا.
- Food and Agriculture: اندازهگیری افزودنیها، بقایای داروهای دامپزشکی و مایکوتوکسینها.
- LC-MS: Narrow-Bore RRHD با مصرف حلال کمتر، سیگنال تمیزتری ارائه میدهند، نکتهای که در برنامههای اجرایی طولانیمدت اهمیت بالایی دارد.
ZORBAX در مقایسه با InfinityLab Poroshell
اگرچه ستونهای InfinityLab Poroshell 120 از نظر فنی خانوادهای جداگانه محسوب میشوند، اما در عمل آنها را زمانی که سرعت یا کارایی اولویت داشته باشد، بهصورت جایگزین ZORBAX بهکار میبریم. Agilent شیمی سطحی ستونها را همراستا کرده است – برای مثال Eclipse Plus C18 با Poroshell EC-C18 و SB-C18 با Poroshell SB-C18 – و همین امر انتقال روش را بهطور کلی روان کرده است. بنا بر تجربهی ما، زمانهای گرادیان ممکن است نیاز به تنظیم جزئی داشته باشند، اما ترتیب بازداری (Retention) و انتخابپذیری (Selectivity) به اندازهی کافی ثابت باقی میمانند تا در انتقالهای تحت مقررات (Regulated) قابل اعتماد باشند.
انتخاب ستون ZORBAX مناسب
هنگام انتخاب یک فاز ZORBAX، ما سه متغیر اصلی را در نظر میگیریم:
- ویژگیهای آنالیت شامل اندازهی مولکولی، قطبیت و pKa.
- نیازهای فاز متحرک شامل شرایط اسیدی با TFA در مقابل شرایط قلیایی با هیدروکسید آمونیوم (Ammonium Hydroxide).
- محدودیت فشار دستگاه. یعنی این که آیا با یک دستگاه HPLC قدیمی 1100 کار میکنیم یا یک سیستم UHPLC مدرن مدل 1290 Infinity II.
هماهنگکردن این عوامل تضمین میکند که ستون انتخابشده طول عمر و کارایی مورد انتظار را ارائه دهد.
پرسشهای متداول ستونهای ZORBAX
۱- کدام ستون ZORBAX برای پروتئینهای دستنخورده (intact protein) توصیه میشود؟
ستونهای 300SB-C18 یا 300SB-C8. منافذ 300 Å در این ستونها به پروتئینها امکان دسترسی کامل به فاز ساکن را میدهند، بدون ایجاد پیکهای پهن و اعوجاجی که معمولا در بسترهای 100 Å مشاهده میشود.
۲- آیا ستونهای ZORBAX RRHD در فشار کامل UHPLC پایدار هستند؟
بله. ما این ستونها را تا فشار 1200 bar زیر فشار قرار دادهایم؛ بدون آنکه دچار فروپاشی ستون یا افزایش غیرعادی Backpressure شوند. شستوشوی منظم با حلالهای با خلوص بالا عمر ستون را بهطور قابل توجهی افزایش میدهد.
۳- آیا میتوان به صورت مستقیم از ZORBAX Eclipse Plus به Poroshell 120 EC-C18 تغییر داد؟
بله، هرچند معمولا نرخ جریان و شیب گرادیان را دوباره بهینهسازی میکنیم. ذرات سطحی متخلخل در Poroshell پیکهایی تولید میکنند که اندکی باریکتر هستند. این موضوع ممکن است در صورت بالا بودن Dispersion سیستم بر تفکیک اثر بگذارد.
