زمان بازداری (Retention Time) در آنالیز GC-MS

همان‌طور که در تصویر شماره‌ی 1 نشان داده شده، داده‌های GC-MS سه‌بعدی است. محور X مقدار Retention Time (زمان بازداری) را نشان می‌دهد، یعنی زمانی که از تزریق نمونه طول می‌کشد تا آن ترکیب به دتکتور برسد. این پارامتر را به صورت تعداد اسکن نیز می‌توان مشاهده کرد که در حقیقت، تعداد نقاط داده است که به وسیله‌ی MS در طی فعالیت به دست می‌آید. محور Y، پاسخ یا شدت اندازه‌گیری‌شده توسط آشکارساز یون است. محور Z هم مقدار m/z یون‌ها در بازه‌ی جرمی به دست آمده است. برای آشنایی بیشتر با اصول و فرایندی که نمونه در GC-MS طی می‌کند، پیشنهاد می‌کنیم مقاله‌ی GC-MS چیست را مطالعه نمایید.

کروماتوگرام دوبعدی که در تصویر شماره‌ی 2 نشان داده شده، با جمع فراوانی‌های همه‌ی یون‌ها در یک نقطه‌ی داده‌ی واحد و ترسیم آن بر حسب زمان بازداری «RT» بر «تعداد اسکن» برای تولید یک کروماتوگرام کلی یون (TIC) ایجاد می‌شود که با یک کروماتوگرام تولیدشده توسط یک آشکارساز GC مشابهت بیشتری دارد. اما هر نقطه‌ی داده در کروماتوگرام کلی یون، یک طیف جرم مجزا است و معمولا می‌تواند در یک پنجره‌ی جداگانه در نرم‌افزار باز شود. در مثال نشان‌داده‌شده در تصویر شماره‌ی 2، نقطه‌ی داده‌های راس قله‌ی 3 باز شده است.

مثالی از طیف جرمی هیدروکربن زنجیره‌ی مستقیم n-decane را می‌توان در تصویر شماره‌ی 3 مشاهده کرد. یون مولکولی 142 m/z را می‌توان در سمت راست دید. از آن‌جایی که decane یک هیدروکربن اشباع‌ شده است، انرژی اضافی ناشی از یونش را نمی‌توان به صورت داخلی پراکنده کرد و بنابراین اغلب یون‌های مولکولی می‌شکنند که به یون‌های تکه‌ای فراوان و تعداد کمی یون مولکولی منجر می‌شود. هرقدر طول زنجیره‌ی یک هیدروکربن اشباع‌شده بلندتر باشد، فراوانی یون مولکولی کمتر است تا زمانی که هیچ یون مولکولی در طیف جرمی مشاهده نشود. اما یون‌های مولکولی اشباع‌نشده و به ویژه یون‌های دارای پیوندهای دوگانه‌ی ممزوج مانند ترکیبات آروماتیک، خردایش کمتری دارند؛ زیرا انرژی اضافی آسان‌تر می‌تواند در داخل آن حفظ شود. مشاهده‌ی دیگر حاصل از طیف جرمی decane مجموعه‌ی یون‌های تکه‌ای با m/zهای 43، 57، 71، 85،  99 و 113 است که به میزان 14 m/z اختلاف دارند. این‌ها به وسیله‌ی هم‌پوشانی پیوندها در واحدهای متوالی -C₂H₄– تشکیل می‌شوند، اگر بار +1 باشد برابر با جرم 28 واحد اتمی (u) در نظر گرفته می‌شود و یک ویژگی کلیدی طیف‌های جرمی حاصل از هیدروکربن‌ها است. طیف جرمی، مشخصه‌ی منحصربه‌فرد مولکول است و اگر با استفاده از تکنیک یونش و ولتاژ یکسان به دست آید، می‌تواند با کتابخانه‌های طیف‌های به‌دست‌آمده با استفاده از همان تکنیک در همان ولتاژ مقایسه شود. رایج‌ترین کتابخانه‌های تجاری، طیف‌های EI تولیدشده در 70 eV هستند. طیف جرمی را می‌توان برای تعیین فرمول مولکولی و ساختار مولکول با استفاده از جرم‌ یون‌ها، حضور ایزوتوپ‌ها و اتلاف بین یون‌های تکه‌ای نیز تفسیر کرد.

در GC، Retention Time بازداری برای تعیین آنالیت‌های هدف به کار می‌رود و معمولا مساحت برای کمی‌سازی مورد استفاده قرار می‌گیرد. برای کمی‌سازی دقیق، قله‌ها باید تفکیک کروماتوگرافیک خوبی با رزولوشن مرجع داشته باشند که همان‌طور که در تصویر شماره‌ی 2 نشان داده شده، در RT1 و RT2 دارای قله است. طیف جرمی با GC-MS، روش مضاعفی برای تایید آنالیت هدف با استفاده از طیف جرمی کامل یا حضور چند یون و نسبت‌های مربوطه‌ی آن‌ها ارائه می‌کند. کمی‌سازی با استفاده از داده‌های GC-MS به جای استفاده از مساحت زیر قله‌ی TIC، معمولا از مساحت یک یون واحد منحصربه‌فرد حاصل می‌شود؛ زیرا احتمال کمتری دارد که با قله‌های زدودگی هم‌زمان (Co-Eluting Peaks) تداخلی داشته باشد. همچنین تا زمانی که یک یون منحصربه‌فرد را بتوان انتخاب کرد که در قله‌های زدودگی هم‌زمان حضور ندارد و بنابراین قله‌ها به لحاظ طیفی جدا باشند و یک‌پارچگی مرجع به مرجع را بتوان به دست آورد، رزولوشن مرجع کروماتوگرافی برای کمی‌سازی دقیق لازم نیست.

GC-MS در مقابل GC-MS/MS

استفاده از رزولوشن کروماتوگرافی و طیفی برای تفکیک و شناسایی آنالیت‌های هدف بسیار مفید است. اما در تجزیه‌ی آنالیت‌ها با مقادیر جزئی تا حد فمتوگرم (fg) در نمونه‌های بسیار پیچیده مثلا نمونه‌های زیست‌محیطی، غذایی یا زیستی، ماتریس می‌تواند بسیار دشوار باشد. آماده‌سازی نمونه می‌تواند بخش اعظمی از ماتریس را از بین ببرد، اما مولکول‌های آنالیت نیز تا حد زیادی از دست می‌روند. به لحاظ کروماتوگرافیکی، با استفاده از GC x GC که در آن دو ستون با فازهای ایستای مختلف به کار رفته‌اند، قله‌های ماتریس را می‌توان از قله‌های آنالیت جدا کرد. در طیف‌سنجی جرمی، رزولوشن طیفی قابل استفاده است که در آن یون‌های منحصربه‌فرد برای آنالیت هدف انتخاب می‌شوند که در قله‌های ماتریس زدودگی هم‌زمان وجود ندارند. اما در هنگام تجزیه این نمونه‌های بسیار پیچیده، این روش اغلب شکست می‌خورد؛ زیرا یون‌های تکه‌ای از قله‌های مختلف ماتریس زدودگی هم‌زمان، m/z یکسانی با بسیاری از یون‌های حاصل از قله‌ی هدف دارند که سبب عدم تطابق نسبت‌های یون شده و به کمی‌سازی منفی یا غلط منجر می‌گردد.

طیف‌سنجی دوتایی (MS/MS) از چند مرحله (تجزیه‌کننده‌ی جرمی) در طیف‌سنجی جرمی بهره می‌برد تا با کاهش پس‌زمینه‌ی ناشی از قله‌های ماتریس زدودگی همزمان، حساسیت آنالیت را افزایش دهد. ترکیبات زدودگی همزمان با کروماتوگرافی مختلف می‌توانند یون‌های مولکولی/تکه‌ای ایجاد کنند که m/z یکسانی دارند؛ اما این یون‌ها ساختار متفاوتی خواهند داشت. پس از یونش، نخستین تجزیه‌کننده یون را انتخاب می‌کند که یون پیش‌ماده (Precursor Ion) نامیده می‌شود. مرحله‌ی بعدی خردکردن این یون است که معمولا با یک گاز خنثی (مثلا آرگون) در فرایندی به نام تجزیه‌ی ناشی از برخورد (Collision Induced Dissociation به اختصار CID) صورت می‌گیرد. یون‌های تولیدشده به نام یون‌های محصول به ساختار یون پیش‌ماده بستگی خواهند داشت بنابراین طیف جرمی یون محصول از مداخله‌گر(ها) با آنالیت‌ هدف متفاوت خواهد بود. مرحله‌ی بعدی MS/MS تفکیک یون‌های محصول با استفاده از تجزیه‌کننده‌ی جرمی دیگر قبل از آشکارساز یون است. چند پیکربندی مختلف از دستگاه‌های MS/MS از جمله کوادراپل سه‌گانه (QqQ) وجود دارد که در Q1 برای انتخاب پیش‌ماده، Q2 به عنوان سلول برخورد و Q3 به عنوان تجزیه‌کننده‌ی جرمی یون محصول به کار می‌رود. کوادراپل‌های سه‌گانه رایج‌ترین گزینه هستند؛ زیرا دستگاه‌های جرمی واحد بوده و مقرون‌به‌صرفه‌ترند. مثالی از یک چهارقطبی سه‌تایی در تصویر شماره‌ی 4 در حالت پایش واکنش چندگانه (MRM) نشان داده شده است. Q-ToF  از یک چهارقطبی برای انتخاب یون پیش‌ماده و یک HRMS ToF به عنوان تجزیه‌کننده‌ی جرمی یون محصول استفاده می‌کنند. دام‌های یونی قادر به انجام طیف‌سنجی جرمی با همه مراحل موجود در دام واحد (single trap) هستند. همه یون‌ها به جز یون‌های پیش‌ماده خارج می‌شوند و ولتاژی اعمال می‌شود که انرژی را تشدید می‌کند تا یون پیش‌ماده با m/z خاص را ناپایدار و خرد کند. این فرایند را می‌توان برای خردکردن بیشتر تا هر تعداد بار لازم تکرار کرد.

به طور کلی دستگاه‌های MS/MS تنها برای تجزیه‌ی هدف به کار می‌روند و برای تجزیه متداول مواد مجهول استفاده نمی‌شوند. چند حالت عملکرد وجود دارد از جمله

• MRM
• پایش واکنش واحد (SRM) که مشابه اما حساس‌تر است.
• اسکن یون محصول که در آن Q3 در حالت اسکن فعالیت می‌کند تا طیف جرمی کامل یون محصول را به دست آورد
• اسکن اتلاف خنثی.

دستگاه‌های MS/MS را می‌توان به عنوان یک MS استاندارد به کار برد و این کار در طی توسعه‌ی روش در تکنیک‌های MS/MS لازم است اما باید دقت کرد چرا که ممکن است طیف جرمی تولیدشده کیفیت پایینی داشته باشد و روی شناسایی تاثیر بگذارد؛ به‌ویژه برای دستگاه‌های اسکن. برخی سازندگان نیز حالت داده‌یابی دوگانه را ارائه می‌کنند که در آن، داده‌یابی بین مثلا حالت MRM برای تجزیه‌ی هدف و حالت اسکن برای شناسایی موارد مجهول جابه‌جا می‌شود.