کاربردهای رایج UV-Vis

این مقاله، مطلب چهارم از سری مقالات اسپکتروفتومتری UV-Vis است. در سه مطلب قبلی به ترتیب موارد زیر را بیان کردیم. برای مطالعه‌ی هر کدام از مقالات قبلی می‌توانید روی عناوین مقالات کلیک کنید:

• اصول اولیه‌ی اندازه‌گیری UV-Vis
• دستگاه اسپکتروفوتومتر چگونه کار می‌کند؟
• انتخاب بهترین تنظیمات برای اندازه‌گیری درست در دستگاه UV-Vis

در این مطلب قصد داریم در مورد کاربردهای رایج این طیف‌سنجی صحبت کنیم. پیشنهاد می‌کنیم در صورتی که هنور مطالب قبلی را مطالعه نکرده‌اید، ابتدا از طریق لینک‌ها بالا آن مقالات را مطالعه کرده و سپس به مطالعه‌ی این مقاله بپردازید.

شناسایی طیف و ساختار

طیف‌سنجی UV-Vis (فرابنفش – مرئی) در مقایسه با تکنیک‌هایی مثل طیف‌سنجی IR (زیر قرمز) که پیک‌های باریک زیادی ایجاد می‌کند،عموماً فقط چند پیک گسترده را نشان می‌دهد و مقدار محدودی از اطلاعات کیفی را ارائه می‌کند. تنها با وجود چند پیک گسترده، شناسایی یک ترکیب بر اساس طیف مشخص کار دشواری است.

برای آشنایی با دستگاه اسپکتروفتومتر به صفحه مورد نظر مراجعه کنید.

بیشترین جذب توسط ترکیبات آلی ناشی از حضور پیوندهای π (یعنی غیراشباع) می‌باشد.کروموفور که یک گروه مولکولی دارای پیوند π است، هنگامی که در کنار یک هیدروکربن اشباع قرار می‌گیرد، (که طیف جذبی قابل مشاهده‌ای در محدوده ی فرابنفش – مرئی ندارد)، ترکیبی با جذب بین 185 تا 1000 نانومتر را تولید می‌کند.

جدول زیر تعدادی کروموفور را به ما نشان می‌دهد:

وجود یک باند جذبی در یک طول موج خاص اغلب نشانه‌ی خوبی برای حضور یک کروموفور است. با این حال، موقعیت طول موج حداکثر جذب ثابت نیست، اما تا حدی به محیط مولکولی کروموفور و حلالی که نمونه در آن حل می‌شود، بستگی دارد. پارامترهای دیگر مانند pH و دما نیز ممکن است باعث تغییرات در شدت و طول موج حداکثر جذب شوند.

برای شناسایی ترکیبات می‌توان از طیف FT-IR استفاده کرد.

طیف زیرقرمز تبدیل فوریه (FT-IR) حاوی جزئیات بسیار بیشتری نسبت به طیف UV-Vis است. طیفی مانند آنچه که در اینجا نشان داده شده است (قرمز) را می‌توان با تطبیق در برابر مرجعی از طیف FTIR برای شناسایی ترکیب استفاده کرد. در این مورد، شناسایی یک اسید سالیسیلیک دارویی (که طیف مرجع آن به رنگ آبی است) نشان داده شده است.

جفت‌شدن پیوند دوگانه با پیوندهای دوگانه‌ی اضافی، شدت جذب و طول موج باند جذبی را افزایش می‌دهد. برای برخی از سیستم‌های مولکولی، مانند هیدروکربن‌های جفت‌شده یا کاروتنوئیدها، رابطه‌ی بین شدت جذب و طول موج به طور سیستماتیک بررسی شده است. یون‌های فلزهای واسطه دارای تراز انرژی الکترونی هستند که باعث جذب در 400 تا 700 نانومتر در ناحیه‌ی مرئی می‌شوند.

تایید هویت یا شناسایی (تطبیق با طیف مرجع)

اگرچه طیف‌های فرابنفش – مرئی، شناسایی مطلق یک مجهول را امکان‌پذیر نمی‌سازد، اما برای شناسایی یک ماده از طریق مقایسه‌ی طیف اندازه‌گیری‌شده با طیف مرجع استفاده می‌شود. در مواردی که طیف‌ها بسیار مشابه هستند، می‌توان از طیف‌های مشتق شده استفاده کرد.

همان‌طور که در شکل 30 نشان داده شده است، تعداد باندها با مرتبه‌ی بالاتر مشتقات افزایش می‌یابد.این طیف‌های مشتق پیچیده می‌توانند در تجزیه و تحلیل کیفی، چه برای مشخص کردن مواد یا برای اهداف شناسایی مفید باشد. به عنوان مثال، طیف جذبی تستسترون استروئیدی یک نوار منفرد، گسترده و بدون پیک را نشان می‌دهد که در حدود 330 نانومتر متمرکز است، در حالی که مشتق دوم شش پیک مجزا را نشان می‌دهد. اثر افزایش تفکیک‌پذیری ممکن است در شناسایی یک ترکیب ناشناخته نیز مفید باشد.

شکل 2 یک شبیه‌سازی کامپیوتری را نشان می‌دهد. هنگامی که دو باند گوسی با پهنای باند طیفی طبیعی 40 نانومتر (NBW)، که در 30 نانومتر از هم جدا شده‌اند، در حالت جذب اضافه می‌شوند، یک باند منفرد با حداکثر پیک میانه راه بین باند دو جزء ایجاد می‌شود. این دو جزء حل نشده است. با استفاده از مشتق چهارم طیف، این دو باند با حداکثر پیک نزدیک به λmax باندهای جزء اصلی به وضوح قابل مشاهده هستند.

مطالعه بیشتر: تعمیر دستگاه اسپکتروفتومتر

اندازه‌گیری کمی یک مولکول

قانون بیر لامبرت

اگر 100 فوتون نور وارد یک کووت شود و فقط 50 فوتون از طرف دیگر خارج شود، میزان عبور 0.5 یا 50٪ است. به همین ترتیب اگر این 50 فوتون از یک کووت یکسان عبور کنند، فقط 25 فوتون ظاهر می‌شود.

تصویر شماره‌ی سه نمودار عبور نور در طول مسیر کووت را نشان می‌دهد.

لامبرت (1760) عموماً به عنوان اولین بیانکننده‌ی ریاضی این اثر شناخته می‌شود، اگرچه اکنون به نظر می‌رسد که بوگر اولین بار آن را در سال 1729 بیان کرده است.

معادله این است:

T = I/I₀ = e^-kb

اولیه که در آن I₀ شدت نور، I شدت نور عبوری، e پایه‌ی لگاریتم‌های طبیعی، k ثابت (بدون واحد) و b طول مسیر(cm) است.

قانون بیر با قانون بوگر یکسان است، با این تفاوت که قانون بوگر از نظر غلظت بیان شده است. مقدار نور جذب‌شده متناسب با تعداد مولکول‌های جذب‌کننده‌ای است که نور از آن‌ها عبور می‌کند.

شکل چهار نمودار عبور نور برابر غلظت را نشان می‌دهد.

با ترکیب این دو قانون، قانون بیر- بوگر- لامبرت به دست می‌آید:

T=I/I₀=e^-kb

جایی که C غلظت گونه‌های جذب‌کننده است (معمولا g/L یا mg/L)، این معادله را می‌توان با گرفتن لگاریتم به یک عبارت خطی تبدیل کرد و معمولا به شکل زیر بیان می‌شود:

A = –logT = –log(I ⁄ I₀) = log(I₀ ⁄ I) = ∑bc

که در اینجا A جذب و ∑ ضریب جذب مولی است.

این عبارت معمولاً به عنوان قانون بیر شناخته می‌شود.

تصویر 5 نمودار جذب در برابر غلظت را نشان می‌دهد.

ضریب جذب مولی (ε) مشخصه‌ی یک ماده‌ی معین تحت مجموعه‌ای از شرایطِ دقیقاً تعریف‌شده مانند طول موج، حلال و دما است. در عمل، ضریب جذب مولی تا حدی به ویژگی‌های دستگاه مورد استفاده نیز بستگی دارد. به این دلایل، مقادیر از پیش‌تعیین‌شده برای ضریب جذب مولی معمولاً برای تجزیه و تحلیل کمی استفاده نمی‌شود. بنابراین، یک منحنی کالیبراسیون برای ماده مورد تجزیه و تحلیل با استفاده از یک یا چند محلول استاندارد با غلظت‌های شناخته‌شده آنالیت ساخته می‌شود.

برای انتقال الکترونی، تفاوت انرژی بین حالت‌های پایه و برانگیخته نسبتا زیاد است. بنابراین، در دمای اتاق، به احتمال زیاد همه مولکول‌ها در حالت پایه‌ی الکترونی هستند. جذب و بازگشت به حالت اولیه فرآیندهای سریعی هستند و تعادل خیلی سریع حاصل می‌شود. بنابراین، جذب نور UV-Vis از نظر کمی بسیار دقیق است. رابطه‌ی خطی ساده بین جذب و غلظت و سهولت نسبی اندازه‌گیری نور UV-Vis، طیف‌سنجی UV-Vis را مبنای هزاران روش تحلیلی کمی قرار داده است. با فرض این که قانون بیر برای طیف مرتبه‌ی صفر رعایت شود، یک رابطه‌ی خطی مشابه بین غلظت و همه ردیف‌های طیف مشتق وجود دارد:

مرتبه صفر:

A = εbc

مشتق اول:

dA/dλ =(dε/dλ)bc

مشتق nام:

dⁿA/dλ’ = (dⁿ ε/ dλ’)bc

دراینجا، A جذب، ε ضریب جذب مولی، b طول مسیر نمونه و c غلظت نمونه است.

برای کمی‌سازی تک‌جزیی، انتخاب طول موج‌ها با طیف‌های مشتق دشوارتر از طیف جذبی است، زیرا هر دو پیک مثبت و منفی وجود دارند. مشتقات مرتبه‌ی زوج دارای حداکثر یا حداقل اوج در همان λmax با طیف جذب هستند، اما برای مشتقات مرتبه‌ی فرد، این طول موج یک نقطه‌ی تلاقی صفر است. در نظر گرفتن تفاوت بین بالاترین ماکزیمم و کمترین مینیمم پیک، بهترین سیگنال به نویز را می‌دهد (S/N) اما ممکن است منجر به افزایش حساسیت به تداخل سایر اجزا شود.

برای نتایج دقیق، نمونه‌ی مورد تجزیه و تحلیل باید دارای جزء جذبی باشد که کالیبراسیون برای آن انجام شده است. اگر نمونه محلول باشد، باید از نمونه‌ی خالص حلال به عنوان بلانک استفاده شود. ممکن است بتوان یک جزء تداخلی با طول موج دوم را تصحیح کرد.

اندازه‌گیری غلظت

یکی از رایج‌ترین کاربردهای اسپکتروفتومتر UV-Vis اندازه‌گیری کمی غلظت است. همراه با لوازم جانبی پراب (میله) شیب فیبر نوری، می‌توان از اسپکتروفتومتر UV-vis برای اندازه‌گیری مستقیم در ظرف نمونه، بدون نیاز به تخلیه به کووت استفاده کرد.

سینتیک

تجزیه و تحلیل سینتیکی واکنش در شیمی و بیوشیمی برای درک چگونگی وقوع واکنش‌ها است. اسپکتروفتومتری UV-Vis یک تکنیک ایده‌آل برای این کاربرد است. زیرا در آن نمونه از بین نمی‌رود. زمانی می‌توان از آن استفاده کرد که تغییر در واکنش‌دهنده یا محصولات باعث تغییر در جذب در طول موج خاصی در طول زمان شود. با یک سیستم اسکن سریع UV-Vis، می‌توان چندین اسکن را در طول واکنش انجام داد تا امکان تجسم واکنش را فراهم کند و به انتخاب طول موج‌های انتخاب‌شده برای محاسبه سرعت کمک کند.

سینتیک تک‌نقطه‌ای

آنالیز سینتیک تک‌نقطه‌ای، ساده‌ترین روش برای تعیین سرعت واکنش است. یک طول موج منفرد انتخاب می‌شود که معمولاً حداکثر جذب آنالیت مورد نظر است و پس از شروع واکنش، جذب به طور مداوم در آن طول موج نظارت می‌شود. این عمل، منجر به نمودار جذب در برابر زمان می‌شود. همانطور که برای چهار نمونه در تصویر شماره‌ی 7 نشان داده شده است. نظارت بر تغییر جذب در طول زمان به شما این امکان را می‌دهد تا یک واکنش را مطالعه کنید. معمولاً زمانی که جذب متوقف می‌شود، کامل‌شدن واکنش رخ می‌دهد. تصویر شماره‌ی 7 چهار نمونه‌ی مختلف را در 30 دقیقه نشان می‌دهد.

مزیت اندازه‌گیری تک‌نقطه‌ای این است که برای واکنش‌های سریع می‌توان داده‌های پیوسته‌ی نزدیک به هم را جمع‌آوری کرد. زیرا سیستم نیازی به حرکت به طول موج دیگر در طول اندازه‌گیری را ندارد.

سرعت جمع‌آوری داده‌های دستگاه و زمان میانگین سیگنال، عامل محدودکننده در میزان داده‌های قابل جمع‌آوری است.

طول‌موج‌های چندگانه را نیز می‌توان برای اندازه‌گیری‌های سینتیکی تنظیم کرد.استفاده از آن‌ها می‌تواند نظریه‌ای در مورد تولید یک محصول واکنش در یک طول موج و عدم تولید در طول موج دیگر به شما ارائه دهد.

سینتیک اسکن

در اسکن یک محدوده‌ی طول موج در طول زمان می‌تواند اطلاعات بیشتری را هنگام انجام اندازه‌گیری‌های سینتیک ارائه دهد. این اندازه‌گیری بخشی از ارائه‌ی یک تصویر بصری از واکنش در حین وقوع (همانطور که در شکل 7 می‌بینید) است که باعث انعطاف‌پذیری برای انتخاب هر تعداد طول موج در محدوده‌ی اسکن برای انجام محاسبه‌ی سرعت واکنش می‌شود. این اندازه‌گیری شامل تجزیه و تحلیل مصرف واکنش‌دهنده‌ها یا تولید محصولات واکنش با پیشرفت واکنش است. هنگام انجام سینتیک اسکن، اطمینان از این که سیستم UV-Vis می‌تواند به سرعت محدوده‌ی طول موج انتخاب‌شده را اسکن کند، مهم است. اسکن آهسته‌تر، مقدار داده‌های جمع‌آوری‌شده در هر طول موجی را در طول واکنش محدود می‌کند.

سینتیک مخلوط سریع

برای نظارت بر سرعت واکنش یا دو محلول با واکنش سریع ممکن است نیاز به استفاده از لوازم جانبی مخصوص مخلوط سریع یا جریان متوقف شود.

هنگامی که این لوازم جانبی بر روی یک اسپکتروفتومتر UV-Vis نصب می‌شوند، این لوازم جانبی ارسال دقیق دو یا چند محلول را به سلول جریان در داخل UV-Vis، جایی که مخلوط شدن رخ می‌دهد، ارائه می‌دهند. لوازم جانبی جریان متوقف‌شده‌ سیستم UV-Vis را فعال می‌کند تا به محض مخلوط شدن محلول‌ها در سلول جریان، تجزیه و تحلیل را آغاز کند. قابلیت این لوازم شامل توانایی تغییر نسبت مخلوط شدن محلول‌ها و توانایی هم‌دما شدن سلول جریان و واکنش‌دهنده‌ها است. از آن جایی که سرعت جمع‌آوری بسیار مهم است، انتخاب یک سیستم UV-Vis با سرعت جمع‌آوری داده‌ها که برای جمع‌آوری یک سری از نقاط داده در چارچوب زمانی واکنش به اندازه‌ی کافی سریع باشد، مهم است. مثال نشان‌داده‌شده در شکل 8 واکنشی را نشان می دهد که در طول سه ثانیه نظارت شده است.

نکات اندازه‌گیری سینتیک

سرعت یک واکنش را می‌توان تحت تأثیر دما قرار داد. به همین دلیل، حفظ یک نمونه در دمای ثابت می‌تواند مهم باشد، به عنوان مثال، دمای بدن (°37) معمولاً برای واکنش‌های بیولوژیکی انتخاب می‌شود. کووت‌های سرد / گرم شده Peltier یا نگهدارنده‌های کووت با ترموستات آب معمولاً با سیستم UV-Vis برای این منظور استفاده می‌شوند. این لوازم جانبی می‌توانند نمونه را در دمای خاصی نگه دارند یا دما را در طول زمان تغییر دهند.

دقت و تکرارپذیری دما باید به طور دقیق در نظر گرفته شود، زیرا تغییرات جزئی در دما یا سرعت تغییر دما می‌تواند تأثیر قابل توجهی بر نتایج داشته باشد. برخی از سیستم‌ها توانایی اندازه‌گیری دمای نمونه‌ها را مستقیماً از داخل کووت (به جای اندازه‌گیری دمای نگهدارنده‌ی کووت) فراهم می‌کنند. هنگامی که با بازخورد به سیستم کنترل دما ترکیب می‌شود، معمولاً کنترل دمای بهتر نمونه را فراهم می‌کند. همچنین می‌توان از پراب‌های دما در نمونه برای ثبت دمای نمونه به همراه داده‌های جذب استفاده کرد.

هم‌زدن مداوم و تکرارپذیر نمونه‌ها نیز مهم است. هنگام اندازه‌گیری واکنش‌ها در دمای اتاق، هم‌زدن اطمینان حاصل می کند که واکنش‌دهنده‌ها به طور مداوم در طول واکنش مخلوط می‌شوند. برای نمونه‌های ترموستات‌شده، هم‌زدن تضمین می‌کند که هیچ گرادیان دما در سراسر نمونه وجود ندارد. هنگام اندازه‌گیری سیستم‌های پیچیده، ممکن است استفاده از پراب فیبر نوری ترجیح داده شود. یک کابل فیبر نوری به نور اسپکتروفتومتر اجازه می‌دهد تا به نمونه‌ای خارج از اسپکتروفتومتر UV-Vis هدایت شود و این می‌تواند برای اندازه‌گیری فرآیند تولید در جریان، جایی که نمونه در درجه‌ی حرارت یا فشار شدید قرار دارد، یا زمانی که نمونه از نظر فیزیکی قادر به قرار گرفتن در داخل محفظه‌ی نمونه‌ی اسپکتروفتومتر نیست، مفید باشد.

اندازه‌گیری رنگ

رنگ ویژگی مهم یک ماده است. رنگ ماده به قابلیت جذب یا بازتابش در طول موج‌های خاص نور مربوط می‌شود. همانطور که در شکل‌های 10 و 11 نشان داده شده است، چشم انسان رنگ مکمل را می‌بیند که جذب می شود.

در عمل، هم تولید و هم ظهور هرکدام از رنگ‌ها بسیار پیچیده است و به عوامل زیادی بستگی دارد، از جمله:

• طیف نوری که بر روی جسم می‌افتد (تفاوت رنگ‌هایی که در غروب خورشید در مقایسه با وسط روز مشاهده می‌شود را در نظر بگیرید)
• ساختار سطحی یک ماده جامد (فلس‌های ماهی یا پرهای پرنده دو نمونه‌ای هستند که ساختار فیزیکی سطح رنگ دیده‌شده را تغییر می‌دهد)
• زاویه‌ی دید (برخی از سطوح مانند رنگ‌های مرواریدی، با تغییر زاویه‌ای که شما سطح را مشاهده می‌کنید، رنگ تغییر می‌کند).

سیستم‌های تخصصی اندازه‌گیری رنگ، مانند CIE L*a*b و ابزار اندازه‌گیری رنگ ایجاد شده‌اند. در صورت مجهز بودن به نرم افزار مناسب، می‌توان از اکثر اسپکتروفتومترها برای اندازه‌گیری رنگ استفاده کرد. دیدن رنگ نیز تحت تأثیر سطح و توانایی آن در تولید انعکاس چشم‌گیر (آینه‌مانند) یا بازتاب منتشر (پراکنده) است. به دلیل این عوامل، اندازه‌گیری رنگ ممکن است به لوازم جانبی خاصی نیاز داشته باشد که امکان جمع‌آوری و مشاهده‌ی انعکاس چشمی و پراکنده را در زوایای دید مختلف فراهم می‌کند.

یک ابزار اندازه گیری رنگ، طیف UV-Vis یک نمونه را می‌گیرد و آن را به سه مختصات رنگی تبدیل می‌کند که رنگ را در فضای رنگی سه بعدی قرار می‌دهد (به تصویر دوازده مراجعه کنید) و سه مختصات روشنایی، رنگ و رنگ نمونه را مشخص می‌کنند. روشنایی معیاری برای روشن یا تیره‌بودن یک رنگ است. کروما معیاری برای «خلوص رنگ» است و رنگ، رنگ طیفی غالب است – مشابه رنگ‌هایی که در رنگین کمان دیده می‌شود.

اسپکتروفتومتر UV-Vis علاوه بر اینکه برای اندازه‌گیری‌های تطبیق رنگ به‌عنوان مثال اندازه‌گیری رنگ‌های روی یک کالای تولیدی استفاده می‌شود، می‌تواند برای اندازه‌گیری تغییر رنگ در محلول نیز استفاده شود. اندازه‌گیری‌های UV-Vis اغلب برای این که نشان دهد آیا واکنشی رخ داده یا در حال انجام است، بدون بازرسی بصری استفاده می‌شود. سنجش‌های مبتنی بر رنگ یکی از گسترده‌ترین کاربردهای مورد استفاده برای اسپکتروفتومتری UV-Vis است.

اندازه گیری رنگ

اسپکتروفتومترهای UV-Vis برای اندازه‌گیری رنگ مایعات و جامدات استفاده می‌شود. با اندازه‌گیری نور مرئی که از طریق محلول یا ماده منتقل می‌شود یا نوری که از یک سطح منعکس می‌شود، می‌توان رنگ مایع یا ماده را محاسبه کرد. یک سری متشکل از سه عدد برای نشان دادن مختصات رنگ اندازه‌گیری‌شده در یک “فضای رنگ” استفاده می‌شود.

چگونه سیاه، سیاه است؟ از ماهی‌های اعماق دریا بپرس!

محققان، بسیاری از ماهی‌های اعماق دریا را با پوست فوق سیاه پیدا کرده‌اند که کمتر از 0.5 درصد نور ورودی را منعکس می‌کنند. این ماهی‌ها از پوست بسیار سیاه خود استفاده می‌کنند تا در حین شکار طعمه، شناسایی نشوند. در اعماق تاریک دریا، موجودات دریایی اغلب از درخشش بیولومینسانس استفاده می‌کنند تا به آن‌ها کمک کند طعمه یا مهاجمان خود را ببینند. پوست فوق سیاه نور بیولومینسانس را جذب می‌کند و به ماهی اجازه می‌دهد تا از دید خارج شود.

محققان موزه ملی تاریخ طبیعی اسمیتسونیان و دانشگاه دوک، انعکاس پوست ماهی را که 99.5 درصد نور را جذب می‌کند، اندازه‌گیری کردند. این در مقایسه با پرنده عالی بهشتی (99.95٪) و سیاه‌ترین ماده‌ی ساخته‌شده‌ی تا کنون – Vantablack است که 99.96٪ جذب می‌کند. مکانیزمی که ماهی‌ها برای جذب نور استفاده می‌کنند، می‌تواند در پنل‌های خورشیدی، تلسکوپ‌ها، دوربین‌ها و سیستم‌های استتار کاربرد داشته باشد.

تغییرات ساختاری ترکیبات

طیف‌سنجی  UV-Vis می‌تواند برای تعیین بسیاری از ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی ترکیبات استفاده شود. این اندازه‌گیری‌ها می‌توانند یک ترکیب را شناسایی کنند یا خواص خاصی را تعیین کنند.

مطالعات ساختاری

طیف سنجی UV-Vis می‌تواند اطلاعاتی در مورد ساختار پروتئین ارائه دهد. اسپکتروفتومتری UV-Vis نیز غیرمخرب است، بنابراین نمونه‌های گران‌بها قربانی نمی‌شوند. این امر UV-Vis را برای استفاده قبل از تجزیه و تحلیل با تکنیک‌هایی مانند طیف‌سنجی جرمی یا LC ایده‌آل می‌کند. این در مقایسه یک جفت آنتی‌بادی مونوکلونال شبه‌زیستی (بیوسیمیلار) نشان داده شده است.

دمای ذوب پروتئین و اسید نوکلئیک

طیف‌سنجی UV-Vis معمولاً در علوم زیستی برای تجزیه و تحلیل مولکول‌های زیستی مانند پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شود. طیف جذبی پروتئین‌ها به دلیل جذب آمینو اسیدهای معطر(آروماتیک) تریپتوفان، تیروزین و فنیل آلانین است.تجزیه و تحلیل چند جزئی را می توان برای تعیین اینکه چه تعداد از هر اسید آمینه آروماتیک در یک پروتئین دست نخورده وجود دارد استفاده می شود.

یک پروتئین در دمای اتاق دارای ساختار یا ترکیب خاص است که به نوبه خود یک محیط الکترونی خاص برای اسیدهای آمینه معطر ایجاد می کند. یکی دیگر از کاربردهای طیف سنجی UV-Vis، این است که پروتئین ها را در معرض حرارت یا دناتورهای شیمیایی قرار  می دهد و قرار گرفتن آنها در یک دما یا غلظت معین باعث باز شدن یا ذوب شدن پروتئین و از دست دادن ساختار خود می شود.در این فرآیند، محیط الکترونی اسیدهای آمینه آروماتیک تغییر می کند که به نوبه خود منجر به تغییرات یا جابجایی طیفی می شود.

دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA) در حالت طبیعی خود شامل دو رشته مولکول دئوکسی ریبوز است که به صورت مارپیچی حول یک محور پیچیده شده است.

رشته ها توسط پیوندهای هیدروژنی بین بازهای پورین و پیریمیدین به هم متصل می شوند – آدنین به تیمین (A-T) و گوانین به سیتوزین (G-C) متصل می شود.

این بازها اساساً مسئول جذب نور فرابنفش DNA و سایر انواع اسیدهای نوکلئیک با حداکثر پیک در 260 نانومتر هستند.مانند هر سیستم چند جزئی، جذب مشاهده شده هر مولکول اسید نوکلئیک باید با مجموع جذب های فردی برابر باشد:

A_DNA=A _آدنین +A _گوانین +A _{سیتوسین} +A _تیمین

 با این حال، جذب مشاهده شده همیشه به طور قابل توجهی کمتر از حد انتظار است زیرا پیوند هیدروژنی بین پایه ها محیط الکترونی آنها را تغییر می دهد.هنگامی که یک مولکول گرم می شود، پیوندهای هیدروژنی شکسته می شود، مارپیچ مضاعف باز می شود، و جذب افزایش می یابد به طوری که به مقدار مورد انتظار از مجموع همه پایه ها نزدیک می شود (به شکل 15 مراجعه کنید).این فرایند دناتوره سازی به عنوان ذوب یا مذاب حرارتی شناخته می شود.در آزمایش مذاب حرارتی، دمای محلول اسید نوکلئیک دو رشته ای به صورت مرحله ای افزایش می یابد و جذب در 260 نانومتر در هر دما اندازه گیری و به صورت منحنی ذوب رسم می شود (همانطور که در شکل 16 نشان داده شده است).نقطه میانی محدوده دمایی که در آن ذوب اتفاق می افتد مقدار T_m است. مقدار T_m یک نمونه اسید نوکلئیک خاص در درجه اول به درصد جفت های G-C در نمونه بستگی دارد که هر کدام شامل سه پیوند هیدروژنی است (در مقابل، هر جفت A-T حاوی دو پیوند هیدروژنی است).هر چه درصد جفت های G-C در نمونه بیشتر باشد، T_m مشاهده شده بیشتر است.

تغییر در جذب، نشان‌دهنده انتقال‌های متعدد در حین باز شدن مارپیچ DNA است.برای انجام آنالیزهای مذاب پروتئین و DNA، اسپکتروفتومتر UV-Vis باید ابزاری برای تغییر دمای نمونه به طور دقیق و قابل تکرار داشته باشد.پیشرفت‌های اخیر در ابزار دقیق اسپکتروفتومتری کاهش قابل توجهی در زمان‌های سپری شده برای اندازه‌گیری‌های مذاب حرارتی و همچنین دقت دمایی بالاتری نسبت به قبل ارائه می‌دهد.سیستم‌های آنالیز مذاب حرارتی UV-Vis با پروب‌های دمایی داخل کووت یکپارچه موجود هستند که می‌توانند برای کنترل دقیق دمای محلول‌ها در طول آزمایش استفاده شوند. برای اطمینان از گرم شدن همگن نمونه ها، همزن درون کووت نیز ارائه می شود. هنگامی که تعداد زیادی نمونه برای تجزیه و تحلیل وجود دارد، یک نگهدارنده چند سلولی در دستگاه تعبیه شده یا همراه آن ارائه می شود. اکثر لوازم جانبی دمایی پلتیر به یک حمام آب در گردش برای خنک کردن عناصر پلتیر نیاز دارند.نوآوری‌های اخیر استفاده از لایه‌های خنک‌شده با هوا را در بلوک سلولی امکان‌پذیر کرده است.محدوده دمایی مورد نیاز معمولاً بین 0 تا 110 درجه سانتیگراد است و همراه با نظارت بر دمای داخلی و هم زدن، توانایی بالا بردن درجه حرارت نمونه را در طول آنالیز با بیشترین سرعت ممکن فراهم می کند.

تجزیه و تحلیل مذاب حرارتی اسید نوکلئیک

کنترل دمای نمونه یک نیاز کلیدی سیستم مذاب حرارتی UV-Vis است. گرمایش سریع و قابل تکرار را می توان با استفاده از یک پروب دمایی داخل کووت کنترل کرد.

تحلیل چند جزئی

تحلیل‌های چند جزئی با استفاده از طیف‌های UV-Vis تقریباً به اندازه‌ی آنالیزهای تک جزیی انجام شده است. با این حال، از آن جایی که تکنیک‌های مورد استفاده در تحلیل چند جزئی اغلب نتایج نادرستی می‌دهند، به طور گسترده مورد استفاده قرار نگرفتند. یک اسپکتروفتومتر مدرن UV-Vis که به خوبی طراحی شده است، داده‌های دقیق‌تری به دست می‌دهد و تکنیک‌های مدرن رسم منحنی نتایج دقیق‌تری را ارائه می‌دهد و شاید مهم‌تر از آن نشان می‌دهد که نتایج نادرست هستند.

اصل افزایشی

طبق قانون بیر، جذب متناسب با تعداد مولکول‌هایی است که تابش را در طول موج مشخص‌شده جذب می‌کنند. این اصل در صورتی صادق است که بیش از یک گونه جاذب وجود داشته باشد. تمام روش‌های کمی چند جزئی بر این اصل استوارند که جذب در هر طول موج یک مخلوط برابر با مجموع جذب هر جزء در مخلوط در آن طول موج است.

تجزیه و تحلیل چند جزئی بر اساس اندازه‌گیری در تعدادی طول موج برابر با تعداد اجزای مخلوط است. طول موج‌های انتخاب‌شده معمولاً حداکثر جذب هر جزء است. برای کالیبراسیون تعیین ضریب جذب مولی، جذب استانداردهای غلظت‌های شناخته‌شده اجزای خالص برای هر ترکیب در هر طول موج انتخاب شده اندازه‌گیری می‌شود. جذب مخلوط در هر طول موج، مجموع جذب هر جزء در آن طول موج است که به نوبه‌ی خود به ضریب جذب مولی و غلظت هر جزء بستگی دارد.

بنابراین برای دو جزء x و y معادلات عبارتند از:

A’_(x+y) = A’_x + A’_y = e’_xbc_x + e’_ybc_y

A”_(x+y) = A”_x + A”_y = e”_xbc_x + e”_ybc_y

• A’ جذب در طول موج است.
• A” جذب در طول موج است.
• e’ ضریب جذب مولی در طول موج است.
• e” ضریب جذب مولی در طول موج است.
• c غلظت است.
• b طول مسیر است.

این معادلات برای تعیین غلظت هر جزء به راحتی حل می‌شوند. اگر اندازه‌گیری‌ها همیشه عالی بودند، می‌توان نتایج دقیقی را به راحتی برای مخلوط‌هایی با اجزای پیچیده با طیف‌های بسیار مشابه به دست آورد. اما در عمل، خطاهای اندازه‌گیری همیشه رخ می دهد. هنگامی که هم‌پوشانی طیفی عمده وجود دارد، چنین خطاهایی می‌توانند به طور قابل توجهی بر دقت نتایج تأثیر بگذارند. تصویر شماره‌ی هجده یک مخلوط دو جزئی شبیه‌سازی‌شده را بدون هم‌پوشانی طیف‌ها در حداکثر جذب نشان می‌دهد.

همچنین، تصویر شماره‌ی نوزده یک مخلوط دو جزئی شبیه‌سازی‌شده را با هم‌پوشانی قابل توجهی از طیف‌ها در حداکثر جذب نشان می‌دهد.

برای مخلوطی از x و y که در آن cx = cy = 1، جذب اندازه‌گیری‌شده باید به صورت زیر باشد:

اگر خطای 10 درصدی در اندازه گیری A’_{(x + y)} و A”_{(x + y)} رخ دهد، A’_{(x + y)}  = 0.99 (- 10 %) و A”_{(x + y)} = 0.99 (+ 10 %) محاسبه‌ی کمی نتایج نشان‌داده‌شده در جدول زیر را به دست می‌دهد:

مقایسه‌ی نتایج تحلیل چند جزئی برای نمونه‌هایی با هم‌پوشانی طیفی کم و قابل توجه

روش حداقل مربعات

اثر نویز تصادفی را می‌توان با استفاده از اطلاعات طیفی اضافی کاهش داد، یعنی یک سری از نقاط داده را می‌توان برای کمی‌سازی به جای تنها به صورت دو موردی استفاده کرد. در این سیستم به اصطلاح بیش از حد تعیین‌شده، تطبیق حداقل مربعات طیف استاندارد با طیف نمونه‌ی اندازه‌گیری‌شده، نتایج کمی را به همراه دارد (1،2). تصویر شماره‌ی بیست طیفی را برای مخلوط دو جزئی نشان‌داده‌شده در شکل نوزده با خطای تصادفی 10 درصد در هر نقطه‌ی اندازه‌گیری نشان می‌دهد.

با 21 نقطه داده (فاصله‌های 2 نانومتری بیش از 200 تا 240 نانومتر)، نتایج کمی از روش حداقل مربعات دارای خطای کمتر از 1٪ در مقایسه با خطای تقریباً 100٪ از اندازه‌گیری‌های معمول در دو طول موج همان‌طور که در جدول زیر نشان داده شده است.

مقایسه نتایج تحلیل چند جزئی از روش معادلات ساده همزمان و حداقل مربعات

این روش، آنالیز مخلوط‌های با اجزای ساده و مخلوط‌های پیچیده‌تر با طیف‌های مشابه را امکان‌پذیر می‌سازد. باقیمانده‌ی حاصل از محاسبه‌ی حداقل مربعات شاخص خوبی است برای تشخیص این که طیف استاندارد چقدر با طیف نمونه مطابقت دارد. بنابراین شاخص خوبی برای دقت احتمالی نتایج است.

نمونه‌ای از تجزیه و تحلیل چند جزئی، تعیین مقدار پنج هموگلوبین در خون با حداقل آماده‌سازی نمونه است. تصویر شماره‌ی بیست و یک طیف جذبی مشتقات هموگلوبین را نشان می‌دهد. این آنالیز قبلاً با استفاده از تکنیک‌های تحلیلی مختلف از جمله طیف‌سنجی و تیتراسیون انجام می‌شد.

روش‌های دیگر

روش‌های آماری دیگر برای تحلیل چند جزئی شامل روش‌های حداقل مربعات جزئی (PLS)، رگرسیون مؤلفه‌ی اصلی (PCR) و حداقل مربعات چندگانه (MLS) است. در تئوری، این روش‌ها مزایایی نسبت به روش‌هایی که در بالا توضیح داده شد دارند؛ با این حال فرآیند کالیبراسیون می‌تواند بسیار پیچیده‌تر باشد.

الزامات نمونه

معادلات ساده همزمان و روش‌های حداقل مربعات تنها در صورتی نتایج دقیقی به دست می‌دهند که کالیبراسیون با استفاده از استانداردهای خالص یا مخلوطی از استانداردها برای هر جزء در نمونه انجام شود که به طیف UV-Vis کمک می‌کند. نمونه‌ی ناشناخته نباید ظرفیت جذب اضافی داشته باشد.

الزامات دستگاهی

کمی‌سازی تک جزیی معمولاً با اندازه‌گیری با همان ابزار یک استاندارد یا یک سری استانداردها و به دنبال آن یک ناشناخته انجام می‌شود. این فرآیند کالیبراسیون باید مزاحمت دستگاهی را از بین ببرد و دقت طول موج مطلق و دقت نورسنجی مطلق را نسبتاً بی‌اهمیت کند.

از سوی دیگر، تکرارپذیری فتومتریک برای نتایج دقیق ضروری است. اگر اندازه‌گیری‌ها فقط در حداکثر جذب انجام شود، تکرارپذیری طول موج نیز اهمیت کمی دارد زیرا سرعت تغییر جذب با طول موج کم است. با این حال، اگر یک طول موج در کنار باند استفاده شود، تکرارپذیری طول موج اهمیت ویژه ای پیدا می‌کند.

در نهایت، محدوده‌ی خطی ابزاری حیاتی است؛ زیرا فرآیند کالیبراسیون بر یک رابطه خطی متکی است. تجزیه و تحلیل دقیق چند جزئی نیاز به عملکرد سیگنال به نویز عالی دارد، به خصوص اگر از روش معادلات همزمان ساده استفاده شود. در روش حداقل مربعات، داده‌ها از طرفین نوارهای جذب در محاسبه گنجانده می‌شوند که تکرارپذیری عالی طول موج را نیز ضروری می‌کند. علاوه بر این، به دلیل نیاز به داده‌های بیشتر، اسکن سریع برای بهره‌وری ضروری است.

الزامات نرم افزاری

نرم‌افزار تخصصی چند جزئی برای کمک به ایجاد مدل‌های داده برای تجزیه و تحلیل داده‌های جمع‌آوری‌شده در دسترس است. معمولاً نرم افزار مورد استفاده در دستگاه UV-Vis، نرم افزار Carry Win است. این بسته‌های نرم‌افزاری را می‌توان در نرم‌افزار کنترل و گزارش‌دهی نرم‌افزار ابزار و یا به عنوان بسته‌های مستقل گنجاند. اکثر سیستم‌های UV-Vis موجود می‌توانند داده‌ها را در قالب استاندارد صادر کنند که می‌تواند برای پردازش به یک بسته‌ی نرم‌افزاری چند جزئی وارد شود.