روش طیف سنجی UV-Vis

طیف سنجی فرابنفش – مرئی (UV-Vis) در بسیاری از کارهای علمی کاربرد دارد؛ از کشت باکتری، تعیین ویژگی‌های دارو و بررسی خلوص و کیفیت نوکلئیک‌اسید گرفته تا کنترل کیفیت در صنایع نوشیدنی و تحقیقات شیمیایی. در این مقاله قصد داریم درباره‌ی روش طیف سنجی UV-Vis، چگونگی تحلیل داده‌های خروجی ، مزایا و محدودیت‌های این تکنیک و تعدادی از کاربردهای آن صحبت کنیم. با ما همراه باشید.

روش طیف سنجی UV-Vis چیست؟

طیف سنجی فرابنفش – مرئی یک تکنیک تجزیه‌ای است که طول موج‌های مجزای نور فرابنفش یا مرئی را اندازه می‌‌گیرد. در حقیقت یعنی طول موج‌هایی که توسط نمونه جذب می‌شود یا آن‌هایی که از نمونه عبور می کند را با یک نمونه‌ی مرجع یا شاهد مقایسه می‌نماید. این ویژگی تحت تأثیر ترکیب شیمیایی نمونه است و اطلاعاتی را به صورت بالقوه در مورد محتویات نمونه و غلظت آن‌ها در اختیار ما قرار می‌دهد. از آن‌جا که روش طیف سنجی UV-Vis، بر استفاده از نور متکی است، در ابتدا اندکی در مورد نور صحبت می‌کنیم.

نور حامل مقداری انرژی است. این انرژی با طول موج نور نسبت عکس دارد. یعنی طول موج‌های کوتاه‌تر، انرژی بیشتری حمل می‌کنند و نورهای با طول موج بلندتر، حامل انرژی کمتری هستند.

اگر بخواهیم در اتم، یک الکترون از لایه‌‌ی فعلی‌اش به لایه‌ی بالاتر برود، باید مقدار مشخصی انرژی به آن الکترون داد. به این فرایند جذب انرژی می‌گویند. حال با توجه به این که گفتیم نور حامل مقداری انرژی است، ما برای دادن این انرژی به الکترون، به اجسام نور می‌تابانیم.

لازم به ذکر است که این مقدار انرژی برای جابجایی الکترون‌ها در لایه‌های مختلف متفاوت و یکتا است. به همین دلیل در اجسام مختلف، طول موج‌های متفاوتی از نور جذب می‌شود.

چشم انسان‌ تنها قادر است طیفی از نور مرئی – از تقریبا 380 نانومتر که به رنگ بنفش است تا 780 نانومتر که قرمز دیده می‌شود – را با ببیند. نور فرابنفش دارای طول موج‌های کوتاه‌تری نسبت به نور مرئی و در حدود 100نانومتر است. در نتیجه، نور را می‌توان با طول موج آن معرفی کرد که این در روش طیف سنجی UV-Vis برای تحلیل یا تعیین خصوصیات اجسام مختلف مفید است؛ به این صورت که از طول موج‌های خاصی از نور استفاده می‌شود که اجسام در آن بیشترین جذب را دارند.

چگونه یک طیف سنج فرابنفش – مرئی کار می‌کند؟

با این که تفاوت‌های زیادی در طیف سنج‌های فرابنفش – مرئی وجود دارد، برای این که به درک بهتری از نحوه‌ی کارکردن طیف سنج فرابنفش – مرئی برسیم، توجه شما را به اجزای اصلی آن جلب می نماییم که در تصویر زیر ترسیم شده است.

1- منبع نور

برای یک تکنیک مبتنی بر نور، وجود یک منبع پایدار که بتواند نور را با گستره‌ی وسیعی از طول موج‌ها تولید کند، ضروری است. لامپ زنون یکی از لامپ‌هایی است که به عنوان یک منبع نور پرقدرت برای تولید نور مرئی و فرابنفش، بسیار مورد استفاده قرار می‌گیرد. با این وجود، این لامپ‌ها نسبت به لامپ‌های هالوژنی و تنگستنی، گران‌تر و بی‌ثبات‌تر هستند.

برای دستگاه‌هایی که از دو لامپ استفاده می‌کنند، معمولا لامپ هالوژنی یا تنگستنی برای ناحیه مرئی و از لامپ دوتریوم برای تولید نور فرابنفش استفاده می‌شود. به دلیل این که دو منبع نور مختلف برای تولید طول موج‌های مرئی و فرابنفش نیاز است، دستگاه باید در حین اندازه‌گیری، منبع نور را عوض نماید. این تغییر منبع نور معمولا در عمل در هنگام پیمایش طول موج‌های بین 300 و 350 نانومتر اتفاق می‌افتد که در این محدوده، نشر نور از هر دو منبع مشابه است و این تغییر راحت‌تر انجام می‌شود.

2- انتخاب طول موج

در مرحله بعد، باید طول موج‌های مشخصی از نورهای منتشرشده از منبع نور با توجه به نوع نمونه و آنالیت انتخاب شود. روش‌های دردسترس برای این کار عبارتند از:

• مونوکروماتورها
  یک مونوکروماتور گستره‌ی کوچکی از طول موج‌ها را جدا می‌سازد. این کار اغلب توسط توری‌های پراش انجام می‌شود که می‌توانند برای انتخاب زوایای ورودی و انعکاسی بچرخند تا طول موج دلخواه تولید شود. فرکانس شیار توری پراش، اغلب به صورت تعداد شیار در هر میلی‌متر اندازه‌گیری می‌شود. هر چقدر فرکانس شیار توری بیشتر باشد، تفکیک نوری بهتری انجام می‌شود؛ اما در عین حال گستره‌ی طول موجی باریک‌تری هم حاصل می شود. باید توجه داشت که برای رسیدن به اهداف طیف سنجی فرابنفش – مرئی، بین 300 تا 2000 شیار در هر میلی‌متر  تعداد خوبی است، اما معمولا توری‌های مورد استفاده حداقل 1200 شیار در هر میلی‌متر دارند. دقت بفرمایید که کیفیت اندازه‌گیری‌های طیف سنجی، نسبت به عیوب فیزیکی در توری پراش و ترتیب ابزار نوری تفاوت می‌کند. در نتیجه، «توری‌های پراش خط‌دار» که نسبت به « توری‌های پراش هولوگرافیک مشتعل» دارای عیوب بیشتری هستند، کیفیت طیف‌سنجی را بسیار پایین می‌آورند.
• فیلترهای جذبی
  فیلترهای جذبی معمولا از شیشه‌ی نوری یا پلاستیکی ساخته شده و برای جذب طول موج‌های مشخصی بکار می‌روند.
• فیلترهای تداخلی
  فیلترهای تداخلی که فیلترهای دایکرویک نیز نامیده می‌شوند، معمولا از لایه‌های زیادی از مواد دی‌الکتریک ساخته می‌شوند تا تداخل بین لایه‌های نازک این مواد روی دهد. این فیلترها برای حذف طول موج‌های نامطلوب توسط تداخل مخرب بکار می‌روند. بنابراین به عنوان انتخابگر طول موج شناخته می‌شوند.
• فیلترهای قطع جریان
  فیلترهای قطع جریان به نورهایی با طول موج‌های بالاتر(عبور بالا) یا پایین‌تر(عبور کوتاه) از یک طول موج مشخص اجازه‌ی عبور را می‌دهند. این نوع فیلترها معمولا با در کنار فیلترهای تداخلی کار می‌کند.
• فیلترهای میان‌گذر
  فیلترهای میان‌گذر به گستره‌ای از طول موج‌ها اجازه‌ی عبور را می‌دهند که این کار با ترکیب کردن فیلترهای عبور بالا و عبور کوتاه با هم انجام می‌شود.

اغلب از مونوکروماتورها به دلیل تطبیق‌پذیری و تنوعی که دارند برای این منظور استفاده می‌شود. فیلترها اغلب با مونوکروماتورها استفاده می شوند تا گستره‌ی باریکی از طول موج‌های منتخب نور تولید شود و بعدا بتوان با آن اندازه‌گیری‌های دقیق‌تر انجام داد و نسبت سیگنال به نویز را بهبود بخشید.

3- تحلیل نمونه

هر کدام از انتخابگرهای طول موجی که در طیف سنج استفاده شود، نور باید از میان نمونه عبور کند. در تمام تحلیل‌ها، اندازه‌گیری یک مرجع که اغلب به آن نمونه‌ی شاهد می‌گویند، ضروری است. این نمونه‌ی شاهد می‌تواند یک کووت پرشده از یک حلال باشد. اگر محلول بافری‌شده‌ی آبی حاوی نمونه برای اندازه‌گیری‌ها به کار رود، از محلول بافری‌شده‌ی آبی بدون جسم مورد اندازه‌گیری به عنوان مرجع استفاده می‌شود. در هنگام آزمایش کشت‌های باکتریایی، محیط کشت استریل به عنوان مرجع در نظر گرفته می شود. سیگنال نمونه‌ی مرجع بعدا به صورت خودکار توسط دستگاه به کار می رود تا مقادیر صحیح جذب آنالیت‌ها به دست بیاید.

آگاهی از مواد و شرایط به کاررفته در آزمایشات طیف سنجی فرابنفش – مرئی بسیار مهم است. به عنوان مثال، بیشتر کووت‌های پلاستیکی برای مطالعات جذبی فرابنفش نامناسب هستند؛ زیرا  پلاستیک معمولا نور فرابنفش را جذب می‌کند. اما شیشه می‌تواند فیلتر مناسبی باشد. زیرا اغلب شیشه بیشتر نور UVC (100 – 280 نانومتر) و UVB (280 – 315 نانومتر) را جذب می‌کند اما به مقداری از نور UVA (315 – 400 نانومتر) اجازه‌ی عبور را می دهد. بنابراین ظرف کوارتزی برای نگهداری نمونه جهت سنجش آن در ناحیه‌ی فرابنفش ضروری است، زیرا کوارتز نسبت به بیشتر بازه‌ی نور UV شفاف است. به نظر می‌رسد که هوا نیز می‌تواند به عنوان فیلتر عمل کند. زیرا طول موج‌های کوتاه‌تر از حدود 200 نانومتر توسط اکسیژن مولکولی در هوا جذب می‌گردد. تنظیمات گران‌تر و ویژه‌ای برای اندازه‌گیری در محدوده‌ی طول موج‌های کمتر از 200 نانومتر لازم است. معمولا در این موارد از سیستم نوری پرشده با گاز آرگون خالص استفاده می‌شود. سامانه‌های بدون کووت نیز که تحلیل حجم‌های خیلی کوچک از نمونه را ممکن می‌سازد مانند تحلیل DNA یا RNA در دسترس هستند.

4- آشکارسازی

پس از آن که نور از نمونه‌ عبور کرد، یک آشکارساز برای تبدیل نور خروجی به یک سیگنال الکترونیکی خواندنی به کارمی‌رود. معمولا آشکارسازها بر پایه‌ی پوشش‌های فتوالکتریک یا نیمه‌هادی کار می‌کنند.

یک پوشش فتوالکتریک زمانی که در معرض نور قرار می‌گیرد، الکترون‌ها را که دارای بار منفی هستند، دفع می‌کند. هنگامی که الکترون‌ها دفع می‌شوند، یک جریان الکتریکی متناسب با شدت نور تولید می‌شود. لوله فتوتکثیرکننده (PMT) یکی از رایج‌ترین آشکارسازهای به کار رفته در طیف سنجی فرابنفش – مرئی است. PMT نیز از اثر فتوالکتریک بهره می‌برد؛ به این‌گونه که در ابتدا بر اثر برخورد با نور، الکترون‌ها را دفع می‌کند، سپس تکثیر متوالی الکترون‌های دفع‌شده برای تولید جریان الکتریکی بیشتر انجام می‌شود. آشکارسازهای PMT به خصوص برای آشکارسازی مقادیر بسیار کم نور مناسب است.

زمانی که نیمه‌هادی‌ها در معرض نور قرار می‌گیرند، جریان الکتریکی متناسب با شدت نور از میان آن‌ها عبور می‌کند. به ویژه فتودیودها و دستگاه بار جفت‌شده(CCDs) دو نوع از رایج‌ترین آشکارسازهای مبتنی بر فناوری نیمه‌هادی هستند.

بعد از تولید جریان الکتریکی توسط هر کدام از آشکارسازها، سیگنال آن تشخیص داده شده و خروجی آن به کامپیوتر می‌رسد یا نمایش داده می‌شود. تصاویر 2 و 3 برخی از نمودارهای شماتیک ساده‌شده از آرایش‌های طیف سنج فرابنفش – مرئی را نشان می‌دهد.

منبع: وبسایت Technology Networks