اغلب برای افراد این سوال وجود دارد که «از دستگاه خود چه میزان تکرارپذیری باید انتظار داشته باشیم؟» بنابراین اکثر افراد به تکرارپذیری توجه میکنند؛ یعنی باید بتوانیم انحراف معیار نسبی (معمولا بر حسب %RSD) برای مساحت قله یا نتیجهی کمی از تزریقهای مکرر از یک ویال نمونهی واحد را به دست آوریم.
به نظر میرسد که افراد به دنبال راهی برای اندازهگیری خطای دستگاه هستند تا در نهایت این خطا را به عنوان یک عامل تعیینکننده در تکرارپذیری یک آزمایش خاص در نظر بگیرند.
در نظر داشته باشید که قطعا طراحی دستگاه و کیفیت ساخت خیلی مهم است؛ اما اغلب متغیرهای آزمایش، ستاپ دستگاه و نگهداری از تجهیزات است که بیشترین تاثیر را بر تکرارپذیری مساحت قلهها و دادههای کمی دارد.
برای کاربردهای متداول (مثلا برای عیارگیری) میتوان به RSD کمتر از 1% و برای تعیین مقادیر جزئی(Trace Analysis) به RSD بین 2% و 5% رسید. استانداردهای مقرراتی برای صنایع مختلف، انواع تجزیه و غلظتهای آنالیز هدف متفاوت است؛ اما در هنگام ارزیابی تکرارپذیری، به جز تجزیهی مقادیر خیلیکم و کاربردهای بایوآنالیتیکی (یعنی تجزیهی ماتریسهای فیزیولوژیکی)، مقدار RSD کمتر از 2% را باید به عنوان یک راهنما به کار برد. باید راهنمای صنعتی یا شرکتی خود را بررسی کنید تا مطمئن شوید که در تلاش برای رسیدن به ناممکنها نیستید!
اما تا جایی که به این مقاله مربوط است، آیا آنچه که میتوانیم برای اطمینان از تکرارپذیری انجام دهیم، همان است که میتوانیم برای تجزیهی کمی کروماتوگرافی گازی انجام دهیم؟
پیش از مطالعهی ادامه مقاله، خوب است بدانید که ما قبلا در بلاگ صدراپژوهش یک مقاله تحت عنوان «GC چیست؟» آماده کردیم و در آن به صورت کامل در مورد کروماتوگرافی گازی صحبت کردیم. در صورت تمایل، پیشنهاد میشود آن مقاله را پیش از این مطلب مطالعه نمایید.
عوامل بسیاری وجود دارند که در یک آزمایش GC نقش ایفا میکنند و میتوانند روی تکرارپذیری تاثیر بگذارند. بنابراین از نمونه تا آشکارساز را مطرح خواهیم کرد تا دنبالکردن روند کار آسانتر باشد.
- ویالهای باکیفیت انتخاب کنید و در هنگام پرکردن، ویال را فقط تا شانه پر کنید و در بالای نمونهی مایع، کمی فضا باقی بگذارید. این کار از تشکیل خلا/حباب در هنگام تنفس نمونه از ویال جلوگیری میکند. کیفیت شیشهی بهکاررفته در ساخت ویال میتواند در هنگام کار با ترکیبات جذبشونده مهم باشد و این امر باید بر حسب هر کاربرد ارزیابی گردد.
- در هنگام انجام تزریقهای مکرر از یک ویال یکسان برای ارزیابی تکرارپذیری کمی، فراریت حلال نمونه و آنالیت را در نظر بگیرید. وقتی دیواره ویال سوراخ میشود، امکان تبخیر وجود دارد که میتواند روی غلظت نمونه تاثیر بگذارد. برخی کارکنان ترجیح میدهند که 6 ویال مجزا را با یک محلول نمونهی یکسان و هر ویال را تا سطح یکسانی پر کنند.
- انتخاب حلال نمونه به دلیل تفاوت در ضریب انبساط بسیار مهم است؛ زیرا نمونهی مایع در ورودی GC به طور ناگهانی تبخیر میشود. مقدار بخار نمونهی ایجادشده باید در حجم داخلی لاینر ورودی در نظر گرفته شود و حجم گاز ایجادشده به ضریب انبساط حلال، دما و فشار ورودی (جریان حامل) بستگی خواهد داشت. میتوان از یک محاسبهگر حجم بخار برای ارزیابی امکان پرشدن بیش از حد ورودی و ازدسترفتن مقداری از آنالیت در سیستم تحت شرایط عملیاتی شما استفاده کرد. اغلب لاینرها به قطر داخلی 4 میلیمتر قادر به حفظ 900 تا 970 میکرولیتر بخار هستند. یک قانون سرانگشتی خوب، استفاده از 1-2 μL حلال آلی و 5 μL آب تزریقی است؛ اما بهتر است موارد با یک محاسبهگر بررسی شوند. توجه کنید که به دلیل تغییرات زیاد در فشار منبع در هنگام عبور بخار حلال، گاهی اوقات آب میتواند سبب ایجاد مشکلاتی در تکرارپذیری با آشکارسازهای MS و همچنین مشکلاتی با برهمکنشهای فاز گاز با اجزای منبع یون شود که در نهایت منجر به تغییراتی در بازده منبع میشود.
- از سرنگ با حجم مناسب استفاده کنید. سرنگهای 5 μL و 1 μL به نمونههای 10 μL ارجحیت دارند؛ زیرا حجم تزریق تکرارپذیرتری را ارائه میدهند. حجم تزریق کمتر باید با حجم پایین سرنگ مطابقت داشته باشد. بنابراین برای یک تزریق 1 μL یا کمتر، از یک سرنگ 1 μL استفاده کنید.
- شستوشوی سرنگ پارامتری است که اغلب نادیده گرفته میشود و در صورت اجرای صحیح میتواند بار کاری را تا حد زیادی کاهش دهد. شما باید روالهای شستشوی سرنگ و پمپکردن نمونههای خود را امتحان کنید. البته به تجربه دیده شده است که 3 تا 5 بار پرکردن نمونه (که گاهی اوقات پمپکردن خوانده میشود) و سه بار شستوشو از دو ویال حلال مختلف قبل و بعد از تزریق، نتایج خوبی میدهد. مخصوصا اگر نمونه غلیظ باشد، باید از یک تاخیرگر ویسکوزیته (Viscosity Delay) استفاده کنید تا زمان کافی برای نمونهی ویسکوز فراهم کند که در سرنگ بالا بیاید و از ایجاد حجم تزریق متغیر جلوگیری شود.
- سرعت پیستون سرنگ (Syringe Plunger) را بررسی کنید. در جایی که آنالیتهای جوشان بیشتری دخیل هستند، سرعت زیاد پیستون برای توقف نمونهی در حال تبخیر درون سوزن سرنگ که خطر چگالش آنالیتهای جوشان روی سطوح داخلی سوزن سرنگ را به همراه داشته و سبب تجزیهی نمونه میشود، بسیار مهم است.
- مطمئن شوید که ورودی به خوبی نگهداری میشود و این امر شامل تعویض منظم هرگونه فیلتر در خط تفکیک (توصیههای سازنده را مطالعه کنید) و همچنین نظافت مناسب سطوح داخلی ورودی با یک حلال قطبی (اتیل استات خوب عمل میکند) به ازای هر سه تا شش ماه است.
- جدارههای باکیفیتی انتخاب کنید که صاف باشند و اینها را روی سوزن سرنگ نوکمخروطی مناسبی قرار دهید تا ریسک مغزهگیری (Coring) که سبب نوسانات فشار در طی تزریق میشود و با از دست رفتن نمونه روی تکرارپذیری تاثیر میگذارد، به حداقل برسد. علاوه بر این در جایی که ورودیها دارای دریچهی رزوهی پیچی هستند، درپوش ورودی را بیش از حد سفت نکنید؛ زیرا به ترکخوردن دیواره منجر میشود که خطر ازدسترفتن نمونه در طول فاز تزریق را به همراه خواهد داشت. در ضمن همین موارد برای ویالهای دارای درپوش پیچی نیز صدق میکند. مانند همیشه پیشنهاد میکنیم از دستورالعملهای سازندهی دستگاه خود پیروی کنید.
- لاینر خود را با دقت انتخاب کنید! لاینرها برای تزریقهای مجزا و غیرمجزا معمولا دارای طراحی متفاوتی هستند. لاینرهای تزریق مجزا میتوانند مستقیم باشند؛ یعنی هیچ مانع یا پکینگی نداشته باشند یا در جایی که آنالیتهای جوشان با فراریت کم متمرکز شدهاند، میتوانند یک ورودی از پشمشیشه غیرفعال داشته باشند که طوری قرار گرفته است که نوک سرنگ فقط وارد پکینگ میشود. پکینگ برای پاککردن هرگونه آنالیت رسوبکرده از نوک سرنگ عمل میکند تا مساحت زیادی برای آنتالیتهای با فراریت کمتر تشکیل شود تا رسوب کنند و در نتیجه از درون لاینر تبخیر شوند و همچنین از اختلاط مناسب بخار نمونه اطمینان حاصل شود. برای تزریق غیرمجزا، لاینر میتواند حاوی یک ورودی پشم شیشه در زیر لاینر و همچنین یک مانع در خروجی لاینر باشد که هردوی این ویژگیها برای توقف آنالیتها در مواجهه با سطح فلز داغ در کف ورودی است که میتواند در جذب یا تجزیه حرارتی آنالیتهای ناپایدار رخ دهد.
- همواره از لاینرهای ورودی غیرفعال استفاده کنید که تکرارپذیری بهتری ارائه میدهند. بهویژه برای آنالیتهای قطبیتر، لاینر را به صورت بررسی یا تعویض کنید؛ مخصوصا در جایی که ماتریسهای نمونهی کثیفتری وجود دارند. هرگونه آلودگی لاینر، محیطی برای جذب بالقوهی نمونهی شما است و همچنین روی تکرارپذیری کمی تاثیر خواهد گذاشت. توصیهی ما، خرید لاینرهای غیرفعال باکیفیت با طراحی مناسب و تعویض مرتب آنهاست.
- برای تزریق غیرمجزا، دمای اولیهی آوِن باید تا مدتی (30 ثانیه متداول است اما باید بهینه شود) در 20 درجهی سانتیگراد زیر نقطهی جوش حلال نمونهی شما حفظ شود تا از قلههای تیز آنالیت و تکرارپذیری کمی مناسب اطمینان حاصل گردد. علاوه بر این، زمان تزریق غیرمجزا قبل از بازشدن شیر تفکیک نیز باید بهینه شود تا تیزی مناسب قلهی حلال تضمین شود (در صورتی که زمان تزریق غیرمجزا زیاد طول بکشد، قلهی حلال به طور بدی دنباله پیدا میکند) و از اتلاف آنالیت درون خط تفکیک (در صورت کوتاهبودن زمان تزریق غیرمجزا) جلوگیری گردد. این یک پارامتر تجربی بوده و اغلب در زمان اجرای تزریق غیرمجزای کمی بسیار مهم است.
- مکان ستون در ورودی و آشکارساز برای جلوگیری از ایجاد مشکل با تکرارپذیری ضعیف مهم است و باید از دستورالعملهای سازنده در رابطه با نصب ستون به دقت پیروی کرد. این امر به ویژه به تعیین موقعیت ستون در ورودی در هنگام اجرای تزریق غیرمجزا ارتباط دارد و اگر به دستورالعمل سازندهی خود دسترسی ندارید، اکیدا توصیه میکنیم که آن را تهیه کنید. (برای خرید ستون GC کلیک کنید.)
- پاکسازی ستون در چند سانتیمتر اولیه و کیفیت برش ستون نیز میتواند روی تکرارپذیری کمی تاثیر بگذارد. اگر دربارهی بخش ابتدایی ستون اطمینان ندارید، 10 تا 20 سانتیمتر از ورودی را ببرید (مطمئن شوید قلهها هنوز در پنجره قر داخلی هستند که درون سیستم Data ستآپ شدهاند) و از برش خوب ستون اطمینان حاصل کنید (90 درجه نسبت به دیوارهی ستون و بدون پلیسه) که هر دوی اینها پتانسیل جذب آنتالیت را به حداقل میرساند.
- مطمئن شوید ستون در وضعیت مناسبی است. باز هم از دستورالعملهای سازنده پیروی کنید تا تاثیر ستون روی حساسیت و تکرارپذیری به حداقل برسد.
- در هنگام استفاده از آشکارساز FID، مطمئن شوید که آشکارساز تمیز است، ستون به درستی درون آشکارساز قرار دارد و یک جریان/فشار پیوسته از گاز تمیز (عاری از اکسیژن و هیدروکربنها- در جاهای ممکن از فیلتر گاز استفاده کنید) با نسبت استوکیومتری صحیح (معمولا 10:1:1 of Air / Fuel and Makeup) وجود دارد.
- در رابطه با آشکارسازهای MS، باید اطمینان حاصل شود که دستگاه به درستی تنظیم شده و محدودیتهای مشخصات فنی را برآورده میکند.
- سرانجام اگر پس از در نظر گرفتن همه موارد بالا، هنوز مشکلی دارید، میتوانید استفاده از یک استاندارد داخلی برای در نظر گرفتن تغییرات در عملکرد دستگاه را لحاظ کنید. توصیه میشود این موضوع را به عنوان آخرین گزینه در نظر بگیرید. اما در صورت لزوم، مطمئن شوید یک استاندارد داخلی را انتخاب میکنید که خلوص بالا و خواص شیمیایی و نقطهی جوش مشابهی با آنالیت یا آنالیتهای مورد نظر داشته باشد.
سخن پایانی
برای بهینهسازی تکرارپذیری کمی برآوردهای GC خود موارد بسیاری را باید در نظر بگیرید. تمام این موارد باید به دقت مورد ارزیابی قرار گیرد. به نظر این موضوع به یک دوچرخهی قدیمی شباهت دارد، اغلب همه بخشهای لازم وجود دارند، اما کمی قدیمی و زهوار در رفته هستند و برای نو شدن وقت زیادی میگیرد. با کمی دقت و توجه، میتوان به یک وسیلهی درست و خوب رسید. همین موضوع برای سیستمهای کروماتوگرافی صادق است. زیرا اغلب عدم تکرارپذیری خوب، بهندرت یک دلیل فاجعهبار میتواند داشته باشد و معمولا چند عامل کوچک دخیل هستند که به قول معروف «سیستم ریپ میزند». در نهایت باید گفت که اگر به همهی موارد کوچک توجه دقیق نکنیم، ممکن است به عملکرد بهینه نرسیم.
نظرات خود را در مورد این مطلب برای ما در پایین همین صفحه بنویسید. مطالعهی آن برای شما مفید بود؟ در صورت ارسال نظرات، کارشناسان فنی صدراپژوهش به سرعت پاسخ شما را میدهند. از شما بابت کمک به ارتقای علمی این مطلب سپاسگزاریم.
