کروماتوگرافی برهمکنش آب‌دوست – دیدگاه تجربی

مطلبی که در ادامه مطالعه می‌کنید، ترجمه‌شده از یک مقاله به زبان خارجی از که در انتهای متن، لینک آن قرار داده شده است. بنابراین، ضمایری که در متن استفاده شده، همگی از زبان همان نویسنده‌ی اصلی است. امیدواریم مطالعه‌ی این مطلب برای شما مفید باشد. ضمنا در صورت نیاز به استفاده از خدمات آنالیز HPLC کلیک کنید.

افراد بسیاری در مورد تجریه‌ی خود از HILIC این‌گونه می‌گویند که «خب ما HILIC را امتحان کردیم و برای ما که کار نکرد» یا «ما گرادیان فاز معکوس را برداشتیم و آن را برعکس اجرا کردیم».

کروماتوگرافی برهمکنش آب‌دوست می‌تواند ابزار بسیار مفیدی در میان مجموعه ابزارهای تحلیلی ما باشد، اما برخی خصوصیات عملی در رابطه با این مود کروماتوگرافیکی وجود دارد که باید شناخته شوند تا از موفقیت این تکنیک اطمینان حاصل شود.

متعادل‌سازی سبب می‌شود بسیاری از افرادی که برای اولین‌بار HILIC را امتحان می‌کنند، شکست بخورند. یکی از سازوکارهای مهم در کروماتوگرافی HILIC، بخش‌بندی آنالیت‌ها بین شوینده حجمی و یک لایه‌ی غنی از آب در سطح فاز ساکن است. این لایه برای تشکیل و متعادل‌شدن به زمان نیاز دارد و قبل از استفاده به عنوان یک ستون «جدید» معمولا باید با 50 تا 100 حجم ستونی متعادل گردد و متعادل‌سازی مجدد بین تزریق‌ها در مود گرادیان HILIC نیازمند 10 تا 20 حجم ستونی است تا در کار ما، کروماتوگرافی تکرارپذیر حاصل شود. برای آشنایی با تفاوت روش ایزوکراتیک و گرادیان در HPLC کلیک کنید.

Column volume (mL) = π × (column diameter (mm) / 2)² × column length (mm) × 0.68

ماهیت لایه‌ی جذب‌شده‌ی غنی از آب تعیین می‌کند که شوینده باید حداقل حاوی 3% حجم آبی باشد و تجربه‌ی ما این است که حفظ حد بالای ماده آلی 95% به تکرارپذیری عملی کمک می‌کند.

علاوه بر این، با استفاده از مقدار کمتر از 60% ماده آلی (حد پایین واقعی بسته به ماهیت فاز ایستا و شوینده تغییر خواهد کرد) یک شرایط فاز معکوس متداول‌تر ایجاد می‌شود و بار دیگر تکرارپذیری ممکن است تحت تاثیر قرار گیرد و تفسیر نتایج به‌دست‌آمده دشوارتر خواهد شد. اگر حد بالای گرادیان از 50% ماده آبی فراتر رود متعادل‌سازی مجدد ستون زمان بیشتری می‌برد.

ستون‌ها در دستگاه HPLC حکم قلب فرایند را دارند. برای آشنایی با انواع ستون‌ها، مطالعه‌ی راهنمای انتخاب و خرید ستون HPLC کلیک کنید.

استونیتریل تنها ماده آلی نیست! پروپانول نسبت به استونیتریل یک حلال ضعیفتر بوده و متانول به لحاظ الوتروپیکی قوی‌تر است. افزودن 5% از هر یک از این‌ها (مثلا 90:5:5 Acetonitrile:IPA:Water) می‌تواند به افزایش دقت تفکیک کمک فراوانی کند.

در نخستین تلاش برای تفکیک HILIC از یک فاز دیول استفاده کنید. این‌ها را نمی‌توان در بازه‌ی کاری متداول pH ما یونیزه کرد و بنابراین سازوکار تفکیک راحت‌تر شناخته می‌شود؛ زیرا هیچ برهمکنش الکترواستاتیکی بین آنالیت و فاز پیوندی وجود ندارد.

pH شوینده می‌تواند تاثیر قدرتمندی بر گزینش‌پذیری و بازداری داشته باشد اما سازوکارها باید به خوبی درک شود. فازهای آمید تحت شرایط اسیدی‌تر، کاتیونی هستند که می‌تواند به دلیل دافعه یا جاذبه الکتروستاتیکی بازداری بازها را کاهش داده و بازداری اسیدها را افزایش دهد. با افزایش pH شوینده به بیش از 5، فازهای سیلیکای خالص به طور فزاینده‌ای آنیونی می‌شود. بنابراین بازداری اسیدها کاهش یافته و بازداری قلیاها افزایش می‌یابد.

به این ترتیب شناخت pKa هر دو فاز ایستا و آنالیت به منظور درک رفتار کروماتوگرافیکی تحت شرایط pH متغیر اهمیت زیادی دارد.

تغییر درجه‌ی یونش آنالیت، حتی در زمان استفاده از فازهای ایستای دیول می‌تواند بازداری را در مود HILIC افزایش دهد. به عبارت ساده‌تر آنالیت‌های یونیده، قطبی‌تر هستند و بنابراین بخش‌بندی در لایه‌ی آبی قطبی جذب‌شده در سطح فاز ساکن قوی‌تر خواهد بود. (جهت مشاهده و خرید دستگاه HPLC کلیک کنید.)

وقتی شوینده‌های آبی با مقادیر بیشتری از ماده آلی ترکیب می‌شوند، pH سیستم حلال تغییر خواهد کرد. بسته به مقدار حلال آبی در شوینده، یک جابجایی بین 1 تا 1.5 pH به سمت خنثی انتظار می‌رود. این امر به ویژه در هنگام لحاظ کردن حالت یونش آنالیت یا فاز ایستا مهم است.

بافرها می‌توانند بر بازداری و اغلب بر گزینش‌پذیری در حالت HILIC نیز تاثیر زیادی داشته باشند و قدرت بافر زیادی برای حفظ شکل مناسب قله و زمان بازداری تکرارپذیر لازم است. ماهیت بافر به کار رفته و غلظت آن پارامترهای اصلی توسعه این روش هستند. نوع و قدرت بافر، قطبش لایه‌ی آب جذب‌شده را تنظیم می‌کنند، به عنوان یک ضد یون برای هر فاز ایستای یونیزه یا بخش‌های آنتالیت عمل کرده و در زمانی که سازوکارهای بازداری الکتروستاتیک نقش ایفا می‌کنند، به تنظیم نواحی یونیده کمک خواهد کرد. بافرهای آمونیم فرمات و استات در مود HILIC رایج هستند و یک روش مفید، تغییر قدرت یونی از 5mM به 20mM است تا تاثیر روی بازداری و گزینش‌پذیری مشخص گردد.

ثابت نگه داشتن قدرت یونی در زمان اجرای گرادیان در مود HILIC بسیار مهم است. برای کمک به این روش، استفاده از فازهای متحرک مخلوط مفید است برای مثال فاز متحرک A از 100% بافر آبی تشکیل شده و فاز متحرک B باید حاوی 95% استونیتریل و 5% بافر آبی باشد؛ هر دو فاز متحرک را می‌توان با افزودن 5% بافر آبی تغلیظ شده به آب یا استونیتریل تهیه کرد. این روش کمک می‌کند تغییرات در سازوکارهای بازداری در طی گرادیان که می‌تواند به عدم تکرارپذیری منجر شود کاهش یابد.

ضمنا این نکته را در نظر داشته باشید که اطمینان از سلامت دستگاه، یکی از فاکتورهای تاثیرگذار در انجام آژمایشات شما است. برای آشنایی با خدمات پشتیبانی فنی و تعمیر HPLC کلیک کنید.

تفکیک‌های HILIC به ویژه بین قدرت الوتروپیک رقیق‌کننده نمونه و شوینده در زمان تزریق نمونه، دچار تغییرات می‌شود. قله‌های پهن، دنباله‌دار یا مجزا همگی می‌توانند از عدم مطابقت در قدرت الوتروپیک بین رقیق‌کننده نمونه و شوینده ناشی شوند. باید تلاش کرد هر جایی که ممکن است نمونه با استفاده از یک رقیق‌کننده تزریق شود که قدرت شویندگی برابر یا کمتر از ترکیب شوینده اولیه داشته باشد و به لحاظ عملی رقیق‌کننده نمونه باید حاوی حداکثر حجم آب 25% باشد. تغییر pH رقیق‌کننده یا قدرت یونی اغلب می‌تواند در غلبه بر مشکلات انحلال‌پذیری کمک کند.

سازوکار HILIC به قدری در معرض این تغییرات است که باید ماهیت سرنگ یا سوزن حلال شستشو را در نظر گرفت و تا حد ممکن درصد بالای حلال آلی را حفظ کرد.

یک روش بسیار خوب برای بررسی تفکیک HILIC، اجرای یک گرادیان آبی 5-40% با استفاده از یک فاز نوع دیول با بافر 10mM (قدرت یونی ثابت) در pH 2.5، 4 و 6 و ارزیابی نتایج به دست آمده برای هر یک از تنظیمات pH یا قدرت بافر است که ممکن است برای گزینش‌پذیری بازداری یا تفکیک مناسب به دست آمده لازم باشد. اگر زوج قله‌های زیادی وجود داشته باشند، تغییر به یک فاز ایستای متفاوت از قبیل یک آمید یا فاز سیلیکای خالص تاثیرگذارتر است اما توجه کنید که در هنگام تفسیر نتایج با فازهای فوق‌الذکر باید به حالات مختلف یونش آنالیت و سطح فاز ایستا بسیار دقت کرد.

منبع: Crawford Scientific