آماده سازی نمونه برای HPLC در نمونه‌های مایع

در این مقاله قصد داریم به موضوع آماده سازی نمونه برای HPLC در نمونه‌های مایع بپردازیم. با ما همراه باشید.

استخراج مایع – مایع (Liquid-Liquid Extraction به اختصار LLE)

استخراج مایع – مایع (LLE)، جهت جداسازی آنالیت‌ها (ماده‌ی مورد آزمایش) از مزاحمت‌ها، از طریق تقسیم نمونه بین دو مایع یا دو فاز امتزاج‌ناپذیر (Immiscible)، مورد استفاده قرار می‌گیرد (تصویر 1). در استخراج از نوع LLE، یکی از فازها معمولاً آبی بوده و فاز دیگر یک حلال آلی است. ترکیبات آب‌دوست‌تر، فاز آبی قطبی را ترجیح داده در حالی که ترکیبات آب‌گریزتر عمدتاً در حلال آلی یافت می‌شوند. آنالیت‌هایی که به درون فاز آلی جذب می‌شوند، به آسانی و با تبخیر حلال بازیابی می‌شوند. در صورتی که آنالیت‌های جذب‌شده به درون فاز آبی را اغلب می‌توان به طور مستقیم به یک ستون HPLC با فاز معکوس تزریق کرد (برای اطلاع از موجودی و خرید ستون HPLC کلیک کنید.). در برخی موارد، لازم است در فاز حاوی قسمت آبی یک عملیات تعویض حلال، با حلالی که تناسب بیشتری با روش کروماتوگرافی داشته باشد، صورت گیرد. در متداول‌ترین روش جهت LLE، از یک قیف جداکننده استفاده شده (تصویر 2) که در قسمت بالای آن دهانه‌ای برای افزودن دو فاز وجود دارد و در قسمت پایین یک شیر قطع و وصل جهت خارج کردن گزینشی لایه‌ی پایینی پس از انجام فرآیند تقسیم (منظور تقسیم آنالیت بین دو فاز)وجود دارد. در صورتی که حلال آلی چگالی بالاتری نسبت به آب داشته (مانند دی‌کلرومتان) و همچنین در لایه‌ی پایینی قرار داشته باشد، استفاده از قیف جداکننده ارجحیت دارد.

در توضیحات زیر فرض می‌شود که یک آنالیت به صورت ترجیحی در درون فاز آلی متراکم و جمع می‌شود؛ ولی هنگامی که آنالیت به درون یک فاز آبی استخراج می‌شود، رویکردهای مشابهی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

(تصویر 3 )، مراحل گردش کار مربوط به یک جداسازی از نوع LLE را خلاصه می‌کند. از آن جایی که استخراج، یک فرآیند تعادلی با بازدهی محدود است، مقادیر چشمگیری از آنالیت می‌تواند در هر دو فاز باقی بماند. از تعادل‌های شیمیایی مربوط به تغییرات pH، جفت شدن یون، کمپلکس شدن و … می‌توان جهت افزایش بازیابی آنالیت و یا حذف مزاحمت‌ها استفاده نمود.

حلال آلی انتخابی در استخراج به روش LLE بایستی دارای خصوصیات زیر باشد:

• حلالیت اندکی در آب داشته باشد.
• جهت حذف و تغلیظ آسان پس از استخراج، فراریت داشته باشد.
• با تکنیک‌های آشکارسازی HPLC یا GC مورد استفاده جهت آنالیز سازگار باشد. مثلا نباید از حلال‌های حاوی کلر همراه با آشکارساز به دام ‌انداز یا رباینده‌ی الکترون (Electron Capture Detector) استفاده شود. این حلال ها جذب شدید UV دارند یا می‌توانند باعث بروز مشکلاتی در روش تشخیصی GC شوند.
• دارای خواص قطبیت و تشکیل پیوند هیدروژنی که بازیابی آنالیت‌ها را در فاز آلی افزایش می‌دهند، باشد.
• به منظور به حداقل رساندن آلودگی نمونه خلوص بالا داشته باشد.

پیش از مطالعه‌ی ادامه‌ی مطلب، در صورت نیاز به استفاده از خدمات آنالیز HPLC، می‌توانید نمونه‌ی خود را به شرکت صبا آنالیز ارسال نمایید. لازم به ذکر است که تمامی فرایندهای آماده‌سازی نمونه توسط این شرکت انجام می‌شود. برای آشنایی بیشتر با خدمات این شرکت کلیک کنید.

تئوری

قانون توزیع نرنست (Nernst Distribution Law) چنین بیان می‌کند که هر گونه‌ی خنثی تفکیک‌ناپذیر، طوری بین دو حلال امتزاج‌ناپذیر توزیع خواهد شد که نسبت غلظت‌ها (یا به طور دقیق‌تر، فعالیت‌ها) ثابت باقی بماند:

K_D = C₀ / C_aq        (معادله‌ی 1)

که در آن K_D ثابت توزیع بوده، C₀ غلظت (فعالیت) یک آنالیت در فاز آلی و C_aq غلظت (فعالیت) آنالیت در فاز آبی است.
یک عبارت بهتر، کسر آنالیت استخراج شده (E) در معادله‌ی 2 ارائه شده است:

E = C₀V₀ / (C₀V₀ + C_aqV_aq) = K_DV / (1 + K_DV)        (معادله‌ی 2)

که در آن V₀ حجم فاز آلی، V_aq حجم فاز آبی و V نسبت فازی V₀ / V_aq است. بسیاری از استخراج‌ها به روش LLE در قیف‌های جداکننده انجام می‌شود. در نظر داشته باشید در مورد نمونه‌های زیست‌محیطی (مانند آب) معمولاً چند ده یا چند صد میلی‌لیتر از هر فاز مورد نیاز است. در مورد نمونه‌های بالینی (کلینیکی) گاهی اوقات تنها به چند میلی‌لیتر (مثلاً 1 الی 3 میلی‌لیتر) نیاز است.

در مورد استخراج‌­های یک مرحله‌­ای، K_D بایستی جهت بازیابی کمی آنالیت در یکی از دو فاز بزرگ (مثلاً >10 ) باشد؛ زیرا نسبت فازی V باید در یک محدوده­‌ی کاربردی مفید از مقادیر، مثلاً مابین 0.1 و 10 حفظ شود (معادله­‌ی 2). در اغلب روش­‌های LLE با قیف‌­های جداکننده، بازیابی‌­های کمی (بیش از 99%) نیازمند دو یا چند مرحله استخراج است. در مورد استخراج‌های چندگانه‌­ی متوالی، با تجمیع فازهای آنالیت از هر استخراج خواهیم داشت:

E = 1 – [1 / (1 + K_DV)]ⁿ          (معادله‌ی 3)

که در آن n تعداد استخراج‌ها است. به عنوان مثال، در صورتی که در مورد یک آنالیت K_D = 5 باشد و حجم‌های دو فاز برابر باشد ( V = 1 )، سه استخراج ( n = 3 ) جهت بازیابی آنالیت به میزان <99% مورد نیاز است. با روش‌های زیر می‌توان مقدار K_D را افزایش داد:

• می­‌توان حلال آلی را تغییر داد تا مقدار K_D افزایش یابد.
• در صورتی که آنالیت یونی بوده یا قابلیت یونی شدن را داشته باشد، مقدار K_D مربوط به آن را می­‌توان با ممانعت از یونیزه شدن آنالیت به منظور افزایش حلالیت آن در فاز آلی، افزایش داد.
• همچنین آنالیت را از طریق جفت شدن یونی، نیز می‌­توان به درون فاز آلی استخراج نمود، به شرطی که آنالیت، یونیزه شده و یک واکنشگر جفت‌یونی به فاز آبی افزوده گردد.
• از روش «بیرون‌رانی نمک (Salting out)» (رسوب­‌دهی نمک) با افزودن یک نمک بی­‌اثر خنثی (مانند سدیم سولفات) می‌­توان جهت کاهش غلظت یک آنالیت در فاز آبی استفاده کرد.

شرکت صدراپژوهش نزدیک دو دهه است که در زمینه‌ی تعمیر و فروش تجهیزات آزمایشگاهی فعالیت دارد. برای اطلاع از موجودی و خرید دستگاه HPLC کلیک کنید.

اقدام عملی

جدول زیر، مثال‌­هایی از حلال‌های نوعی مربوط به استخراج و همچنین برخی حلال‌­های نامناسب (امتزاج‌­پذیر با آب) جهت استخراج را ارائه می‌­دهد. غیر از ملاحظات امتزاج­‌پذیری (اختلاط)، معیار انتخاب اصلی، شاخص قطبیت حلال P’¹ نسبت به آنالیت است. بیشترین مقدار K_D زمانی به دست می­‌آید که قطبیت حلال مربوط به استخراج با آنالیت مطابقت داشته باشد (مشابه، مشابه را حل می‌­کند (like dissolves like)).

به عنوان مثال، استخراج یک آنالیت غیرقطبی از یک بافت نمونه‌­ی آبی با یک حلال آلی غیر قطبی (P’ کوچک)^1-2 به بهترین وجه صورت می‌­گیرد. یک حلال آلی با قطبیت بهینه را به سادگی می‌­توان با مخلوط کردن دو حلال با قطبیت‌­های مختلف (مثلاً هگزان و کلروفرم) و اندازه‌­گیری K_D نسبت به ترکیب فاز آلی انتخاب نمود. سپس مخلوطی از حلال که بیشترین مقدار K_D را دارا باشد، جهت روش LLE به کار برده می­‌شود. با تغییر گزینش‌پذیری حلال آلی، می­‌توان به تغییرات بیشتری در K_D رسید که جداسازی آنالیت­‌ها از مزاحمت‌­ها را بهبود می‌­بخشد. انتظار می‌­رود که حلال­‌هایی از مناطق مختلف مثلث گزینش‌­پذیری حلال تفاوت‌­ها را در گزینش‌­پذیری ارائه دهد؛ بحث را نیز مشاهده کنید.

هر حلال از ستون 1 را می‌­توان با هر حلالی از ستون 2 مطابقت داد؛ جهت انجام استخراج به روش LLE معمولی، حلال­‌های آلی امتزاج‌پذیر (قابل اختلاط) با آب (ستون 3) نباید با حلال‌­های آبی مورد استفاده قرار بگیرند. در عین حال، افزودن غلظت­‌های بالا از نمک‌­ها (بیرون­‌رانی نمک) یا قندها می­‌تواند قابلیت اختلاط برخی از زوج حلال‌ها (مثلاً آب و استونیتریل) را کاهش داده، به طوری که ممکن است دو لایه تشکیل دهند.

در استخراج با حلال بسته به شرایط انتخابی، اغلب می‌توان آنالیت‌های آلی قابل یونیزه شدن را به درون هر دو فاز انتقال داد. به عنوان مثال، استخراج یک آنالیت اسیدی آلی را از یک محلول آبی در نظر بگیرید. در صورتی که فاز آبی به میزان حداقل 1.5 واحد pH بیش از مقدار pK_a مربوط به آن بافر گردد، آنالیت یونیزه شده و فاز آبی را ترجیح می‌دهد؛ مواد مزاحم با قطبیت کمتر به درون فاز آلی استخراج می‌شوند. اگر pH مربوط به محلول آبی کاسته شود ( pK_a>>)، به طوری که آنالیت دیگر یونیزه نشود، در این صورت آنالیت به درون فاز آلی استخراج شده و مزاحمت‌های با قطبیت بیشتر را در فاز آبی باقی می‌گذارد. استخراج‌های متوالی در pH بالا و به دنبال آن در pH پایین، امکان جداسازی یک اسید را از مواد مزاحم با قطبیت کمتر و بیشتر، فراهم می‌سازد. توجه داشته باشید که اصول استخراج اسید – باز به صورت تابعی از pH ، همانند اصول LLE و HPLC با فاز معکوس است.

در صورتی که K_D مربوط به آنالیت نامطلوب باشد ممکن است جهت بهبود بازیابی، استخراج‌­های بیشتری مورد نیاز باشد (معادله­‌ی 3). در مورد یک آنالیت محلول در فاز آلی، یک قسمت تازه از حلال آلی امتزاج‌­ناپذیر به فاز آبی افزوده شده تا ماده‌­ی حل شده‌­ی مازاد را استخراج کند؛ سپس تمام مواد استخراج‌شده با هم ترکیب می‌­شوند. در مورد حجم معینی از حلال نهایی استخراج، معمولاً استخراج‌­های متعدد با حجم‌­های کوچک‌تر انجام می‌شود تا حذف کمی مؤثر یک ماده­‌ی حل شده، کارآمدتر از یک حجم استخراج مجزا باشد.

از استخراج معکوس (برگشتی Back Extraction) می‌توان جهت کاهش بیشتر مزاحمت‌­ها، استفاده نمود. به عنوان مثال، مثال قبلی در مورد یک آنالیت اسیدی آلی را در نظر بگیرید. در صورتی که آنالیت در ابتدا در pH پایین به درون فاز آلی استخراج گردد، مزاحمت‌­های قطبی (از قبیل مواد خنثی آب‌دوست و بازهای پروتونه شده) در فاز آبی باقی می­‌مانند. در صورتی که یک قسمت تازه از بافر آبی با pH بالا جهت استخراج معکوس فاز آلی مورد استفاده قرار بگیرد، اسید آلی یونیزه شده مجدداً به درون فاز آبی انتقال یافته و مزاحمت‌­های غیر قطبی در درون فاز آلی باقی می‌­مانند. روش دوم مشابه استخراج‌­های متوالی در pH بالا و به دنبال آن در pH پایین که در قسمت فوق توضیح داده شد، است. بنابراین، یک استخراج برگشتی دو مرحله­‌ای با یک تغییر pH، امکان حذف هر دو نوع مزاحمت‌ بازی و خنثی را فراهم می‌­آورد، در صورتی که یک استخراج تک مرحله‌­ای تنها قادر به حذف یکی از این دو نوع مزاحمت (و نه هر دو نوع آن) است.

در صورتی که K_D بسیار کوچک بوده (خیلی بیشتر از 1 نباشد) یا مقدار مورد نیاز از نمونه زیاد باشد، عملاً امکان انجام استخراج‌های چندگانه جهت بازیابی مقدار کمی موثر از آنالیت، وجود ندارد. تعداد استخراج­‌های بسیار زیادی لازم بوده و حجم کل استخراج بسیار بزرگ خواهد شد (معادله‌­ی 3). همچنین اگر استخراج آهسته و کند باشد، زمان زیادی جهت برقراری تعادل مورد نیاز است. در این موارد می‌­توان از استخراج مایع – مایع پیوسته (Continuous Liquid-Liquid Extraction) استفاده نمود، که در آن حلال تازه به طور پیوسته از نمونه‌ی آبی بازیابی می‌­گردد.

استخراج­‌کننده‌های (Extractor) پیوسته، با استفاده از حلال­‌های سنگین‌­تر و سبک‌­تر از آب توصیف شده­‌اند. این دستگاه­‌های استخراج، می‌­توانند در مدت‌­های طولانی (12 الی 24 ساعت)، کار کرده و استخراج‌­های کمی (بازیابی >99%)، حتی جهت مقادیر کوچک قابل دستیابی است.

جهت LLE با کارآیی بیشتر، یک دستگاه توزیع با جریان مخالف (Countercurrent Distribution Apparatus) می‌­تواند هزاران مرحله‌­ی تعادلی یا بیشتر (ولی با زمان و تلاش بیشتر) ارائه دهد. این امر، امکان بازیابی آنالیت‌­هایی با مقادیر K_D فوق­‌العاده کوچک را فراهم می‌­سازد؛ توزیع جریان مخالف همچنین امکان جداسازی بهتر آنالیت‌­ها را از مزاحمت‌­ها فراهم می‌­کند. واحدهای آزمایشگاهی در مقیاس کوچک از نظر تجاری در دسترس هستند.

در برخی موارد، LLE می‌تواند غلظت آنالیت را در قسمت محصول استخراج، نسبت به غلظت آنالیت در نمونه­‌ی اولیه افزایش دهد. بر طبق معادله­‌ی 2، با انتخاب حجم کوچکتری از حلال آلی، غلظت آنالیت از طریق نسبت حجمی فازهای آلی به آبی (با فرض استخراجِ تقریباً کامل به درون فاز آلی یا فرض K_D بزرگ) قابل افزایش است. به عنوان مثال، مقادیر 100mL از نمونه‌­ی آبی، 10mL حلال آلی و یک K_D بزرگ (مثلاً K_D > 1000) را در نظر بگیرید. در این صورت، غلظت آنالیت در فاز آلی با ضریب 10 افزایش خواهد یافت. در مورد نسبت‌­های بزرگ از حلال آبی به آلی، انحلال اندک حلال آلی در فاز آبی، می­‌تواند حجم حلال آلی بازیابی شده را به میزان چشم‌گیری کاهش دهد؛ این معضل با اشباع قبلی حلال آبی با حلال آلی قابل پیشگیری است. توجه داشته باشید که اگر نسبت V₀ / V_aq حلال کوچک باشد، دستکاری فیزیکی این دو فاز و نیز بازیابی فاز آلی بسیار مشکل می­‌گردد.

سخن پایانی

در این مطلب سعی کردیم به توضیح آماده سازی نمونه برای دستگاه HPLC ،در نمونه های مایع بپردازیم. امیدواریم که این مطلب برای شما مفید بوده باشد. در پایان خوشحال می‌شویم که سوالات و نظرات علمی شما عزیزان را در این‌باره بدانیم. شما می‌توانید بدون نیاز به عضو شدن در سایت، نظرات خود را در پایین همین صفجه بنویسید تا در صورت نیاز، کارشناسان ما در اسرع وقت به آن پاسخ دهند.

مطلب پیشنهادی: HPLC جیست؟