توسعه روش‌ HPLC – بررسی تخریب داروها – مطالعات پایداری

در توسعه‌ی محصولات دارویی، یک آزمون برای تشخیص پایداری، صرفا یک الزام نظارتی نیست؛ بلکه سنگ‌بنای کیفیت آن محصول است. مطالعات تخریب اجباری (Forced degradation studies)، زمانی که با دقت علمی و طراحی روش‌مند اجرا شوند، به‌عنوان پایه‌ای برای این آزمون‌ها عمل می‌کنند.

در این مقاله، بهترین روش‌ها برای طراحی، توسعه و اعتبارسنجی آنالیز HPLC با قابلیت نشان‌دهی پایداری که با الزامات ICH Q1A(R2) هم‌راستا هستند، مورد بررسی قرار می‌گیرد؛ در نظر داشته باشید که این بررسی با تمرکز بر تست‌های تنشی، جداسازی محصولات تخریب، تأیید تشخیص‌پذیری و استفاده از طراحی آزمایش (DoE) برای بهینه‌سازی روش انجام شده است.

۱- طراحی هدفمند مطالعات تخریب اجباری

تخریب اجباری گاهی به‌اشتباه به‌عنوان یک فعالیت روتین و صرفا برای تکمیل مستندات در نظر گرفته می‌شود. اما اگر این فرآیند با دقت علمی طراحی و اجرا شود، می‌تواند اطلاعات ارزشمندی درباره نقاط ضعف مولکول دارویی و مسیرهای تخریب آن به ما بدهد. طبق دستورالعمل ICH Q1A(R2)، انجام تست‌های تنشی برای شناسایی محصولات تخریب احتمالی و بررسی عملکرد روش‌های تحلیلی از نظر توانایی در تشخیص این تغییرات، ضروری است.

هدف از تخریب اجباری، نابودی کامل ماده‌ی مؤثر دارویی نیست، بلکه باید میزان مشخص و قابل کنترلی از تخریب – معمولاً بین ۵ تا ۲۰ درصد – ایجاد شود. این مقدار بستگی به پایداری خود ترکیب دارد. اگر تخریب بیش از حد باشد، ممکن است محصولات میانی دیده نشوند. از طرفی، اگر تنش کافی نباشد، برخی از ناخالصی‌های مهم قابل شناسایی نخواهند بود. بنابراین، شرایط تنش باید به‌گونه‌ای انتخاب شوند که بتوانند وضعیت‌های احتمالی خرابی محصول را در طول زمان به‌خوبی شبیه‌سازی کنند.

نکات مهم:

• پیش از شروع توسعه‌ی روش تحلیلی، اهداف تخریب و الگوهای سرعت واکنش را مشخص کنید.
• از مطالعات تخریب اجباری برای ترسیم نقشه‌ای از نحوه و میزان تخریب استفاده کنید؛ چه ترکیباتی تشکیل می‌شوند، در چه بازه‌ی زمانی و تحت چه شرایطی.
• هر مسیر تخریب را جداگانه بررسی کنید تا تداخل بین واکنش‌ها باعث ایجاد اشتباه در تفسیر نتایج نشود.

۲- تست‌های تنشی؛ انتخاب درست شرایط

برای انجام یک مطالعه‌ی تخریب اجباری کامل و استاندارد، لازم است ماده‌ی دارویی تحت پنج نوع تنش مختلف قرار گیرد:

• اسیدی و بازی
• اکسیداتیو
• حرارتی
• نوری

هر یک از این شرایط، بخش‌های خاصی از ساختار شیمیایی مولکول را هدف قرار می‌دهند و اطلاعات متفاوتی از پایداری آن به ما می‌دهند که در ادامه به بررسی آن‌ها می‌پردازیم.

هیدرولیز اسیدی و بازی

• این تست‌ها معمولاً با اسید کلریدریک (HCl) یا سدیم هیدروکسید (NaOH) با غلظت1 تا 1 مولار و در دماهای بالا انجام می‌شود.
• برای بررسی حساسیت گروه‌هایی مثل استر، آمید، لاکتام و کربامات به شکستن در برابر آب مفید هستند.
• قبل از تزریق به HPLC، باید واکنش را خنثی و متوقف کرد تا نه به ستون آسیب برسد و نه تخریب ادامه پیدا کند.

تخریب اکسیداتیو

• معمولاً از پراکسید هیدروژن (H₂O₂) با غلظتی بین 3 تا 30 درصد استفاده می‌شود.
• ین نوع تنش ترکیبات حساس به اکسیداسیون مانند فنول‌ها، آمین‌های نوع سوم و تیواترها را تجزیه می‌کند.
• باید مراقب باشید که اکسیداسیون بیش از حد رخ ندهد؛ چون ممکن است باعث تشکیل ناخالصی‌های جدید در طول ذخیره‌سازی شود.

 تنش حرارتی

• ماده‌ی دارویی را در بازه‌ی دمایی 60 تا 105 درجه‌ی سانتی‌گراد و تحت شرایط خشک یا مرطوب قرار می‌دهند.
• اگر ماده به‌صورت پودر است، تست حرارتی در حالت جامد مناسب‌تر است. ولی برای فرمولاسیون‌های محلول، شرایط مایع اولویت دارد.

تخریب نوری

• طبق دستورالعمل ICH Q1B، نمونه باید نور معادل 2 میلیون لوکس‌ساعت و تابش UV برابر با 200 وات‌ساعت بر متر مربع دریافت کند.
• استفاده از ظروف کوارتز برای عبور اشعه‌ی UV ضروری است؛ چون ظروف معمولی ممکن است نور را مسدود کنند.
• استفاده از نمونه‌های شاهد (کنترل) لازم است تا اثر نور از اثر گرما قابل تفکیک باشد.

نکته: حتماً نمونه‌ها را در زمان‌های مختلف آنالیز کنید تا بتوانید رفتار تخریبی ماده را در طول زمان بررسی کرده و به درک بهتری از سرعت و مسیر تخریب برسید.

۳- جداسازی API از محصولات تخریب‌شده

در آزمون‌های پایداری یکی از مهم‌ترین بخش‌ها، جداسازی دقیق ماده‌ی مؤثر دارویی (API) از محصولات تخریب آن است. این جداسازی باید به‌گونه‌ای انجام شود که هر ترکیب در زمان مشخص و جدا از سایر اجزا ظاهر شود. از نظر مقررات، جداسازی مؤثر زمانی پذیرفته است که رزولوشن (Rs) بین API و هر ناخالصی یا محصول تخریب‌شده حداقل 2 باشد؛ این یعنی تفکیک قابل‌اعتماد بین پیک‌ها.

برای رسیدن به این سطح از دقت، باید چندین عامل کلیدی در طراحی روش HPLC در نظر گرفته شود:

انتخاب نوع ستون

در اغلب موارد از ستون‌های C18 استفاده می‌شود. اما در شرایطی که تفکیک به‌خوبی انجام نشود، می‌توان از ستون‌های دیگر مانند فنیل، سیانو یا HILIC استفاده کرد که هرکدام ویژگی‌های انتخابی متفاوتی دارند و ممکن است در جداسازی ترکیبات خاص مؤثرتر باشند.

ترکیب فاز متحرک

نسبت حلال آلی (مثل استونیتریل یا متانول)، pH و قدرت بافر می‌تواند به‌شدت بر جداسازی تأثیر بگذارد. باید این پارامترها را طوری تنظیم کرد که حداکثر تفاوت در رفتار اجزای مختلف در ستون ایجاد شود.

طراحی گرادیان

پروفایل شیب حلال در طول زمان (گرادیان) نیز اهمیت زیادی دارد. گرادیان‌های تند ممکن است باعث شوند ناخالصی‌هایی که دیرتر ظاهر می‌شوند، به‌درستی دیده نشوند. استفاده از گرادیان‌های ملایم‌تر فرصت بیشتری برای جداسازی دقیق اجزا فراهم می‌کند.

نکته مهم: اگر محصولات تخریب‌شده از نظر ساختار شیمیایی به API شباهت دارند، انتخاب‌پذیری روش کروماتوگرافی به‌چالش کشیده می‌شود. در چنین شرایطی، می‌توان از عوامل جفت یونی یا فازهای ساکن خاص استفاده کرد تا اختلاف رفتاری بین ترکیبات افزایش یابد و جداسازی با دقت بیشتری انجام شود.

۴- بررسی ویژگی روش با استفاده از ابزارهای تشخیص خلوص پیک

برای آنکه بتوانیم ادعا کنیم یک روش HPLC واقعاً «پایداری‌سنج» است، تنها جداسازی ظاهری پیک‌ها کافی نیست. باید مطمئن شویم که هیچ ترکیب دیگری در زیر پیک اصلی پنهان نشده است. در واقع، باید بررسی کنیم که هر پیک واقعاً مربوط به یک ترکیب خالص است و با چیزی هم‌زمان نشده است.

برای این کار از ابزارهایی مانند آشکارساز آرایه‌ی دیودی (PDA) و طیف‌سنج جرمی (MS) استفاده می‌شود که اطلاعات بیشتری نسبت به کروماتوگرافی ساده ارائه می‌دهند.

آشکارساز PDA

• این آشکارساز طیف UV را در نقاط مختلف پیک بررسی می‌کند. (در رأس، شانه‌ها و دنباله‌ی پیک)
• اگر شکل طیف در این نقاط یکسان باشد، نتیجه می‌گیریم که پیک خالص است.
• اگر زاویه‌ی خلوص کمتر از آستانه‌ی دستگاه باشد، پیک به احتمال زیاد خالص است.

محدودیت: اگر ناخالصی هم‌زمان با API بیاید و طیف UV مشابهی داشته باشد، PDA ممکن است نتواند آن را تشخیص دهد.

آشکارساز MS

• با استفاده از طیف جرم (m/z) می‌توان وجود ناخالصی‌های هم‌زمان را که از نظر جرمی متفاوت‌اند، شناسایی کرد.
• این روش برای بررسی خلوص پیک‌هایی که PDA قادر به تمایز آن‌ها نیست بسیار مفید است.
• همچنین، امکان بررسی «تعادل جرم» در نمونه را فراهم می‌کند، یعنی مجموع API و محصولات تخریب باید به حدود 100% نزدیک باشد.

روش‌های کروماتوگرافی متنوع (Orthogonal Chromatography)

• گاهی استفاده از یک روش کروماتوگرافی دیگر با مکانیسم متفاوت (به عنوان مثال HILIC به‌جای RP-HPLC می‌تواند اطمینان بیشتری از خلوص و جداسازی واقعی به ما بدهد.
• این کار به‌ویژه در مراحل پایانی توسعه‌ی روش یا برای تأیید نهایی مفید است.

نتیجه‌گیری: استفاده‌ی ترکیبی از PDA، MS و گاهی روش‌های جایگزین کروماتوگرافی، تصویر کامل‌تری از خلوص پیک‌ها به ما می‌دهد و اطمینان از ویژگی روش را افزایش می‌دهد.

۵- بهینه‌سازی روش با استفاده از طراحی آزمایش (DoE)

در گذشته، برای بهینه‌سازی روش‌های کروماتوگرافی معمولا فقط یک متغیر را در هر مرحله تغییر می‌دادند (روش تک‌عاملی یا OVAT). این کار زمان‌بر و پرهزینه بود و ممکن بود تعامل بین عوامل مختلف را نادیده بگیرد. امروزه، استفاده از طراحی آزمایش (Design of Experiments یا DoE) این مشکل را برطرف کرده و تبدیل به یک ابزار قدرتمند برای توسعه‌ی سریع، علمی و کارآمد روش‌های تحلیلی شده است.

DoE به ما این امکان را می‌دهد که چند متغیر را به‌صورت هم‌زمان بررسی کنیم و اثرات آن‌ها را – چه به‌صورت تکی و چه در ترکیب با هم – بر عملکرد روش ارزیابی کنیم.

عوامل رایج در طراحی آزمایش HPLC

• pH بافر: تعیین بهترین محدوده‌ای که در آن جداسازی حداکثری بین API و محصولات تخریب حاصل می‌شود.
• نسبت حلال آلی: بررسی اثر درصد استونیتریل یا متانول در فاز متحرک بر زمان بازداری (Retention Time) و تقارن پیک‌ها.
• دمای ستون: برخی ترکیبات به تغییرات دما حساس هستند و بهبود تفکیک با تنظیم دما حاصل می‌شود.
• شیب گرادیان: تنظیم شدت و زمان‌بندی تغییر ترکیب فاز متحرک برای تفکیک بهتر پیک‌های نزدیک.

انواع طراحی‌های آماری پرکاربرد

• فاکتوریال کامل (Full Factorial) یا مرکب مرکزی (Central Composite) برای مرحله‌ی غربال‌گری و تعیین عوامل مؤثر.
• طراحی D-optimal برای زمانی که تعداد آزمایش‌ها باید محدود باشد؛ ولی همچنان اطلاعات کافی جمع‌آوری شود.

شاخص‌های پاسخ (Response Variables) که اندازه‌گیری می‌شوند

• زمان بازداری (Retention Time)
• رزولوشن بین پیک‌ها
• تقارن و پهنای پیک‌ها
• تعداد صفحات نظری (Efficiency)

خروجی نهایی

• تعیین فضای طراحی (Design Space) یعنی ناحیه‌ای از شرایط کاری که در آن روش عملکرد قابل قبولی دارد و جداسازی به‌درستی انجام می‌شود.
• شناسایی پارامترهای بحرانی روش (Critical Method Parameters یا CMPs) و تعیین محدوده‌ی قابل‌قبول برای هرکدام.

نتیجه: استفاده از DoE نه‌تنها باعث صرفه‌جویی در زمان و منابع می‌شود، بلکه منجر به توسعه‌ی روش‌هایی پایدار، تکرارپذیر و مقاوم به تغییرات جزئی می‌شود؛ این موضوع دقیقا همان چیزی است که سازمان‌های نظارتی از یک روش تحلیلی انتظار دارند.

۶- اعتبارسنجی روش؛ ارزیابی ویژگی (Specification)، خطی‌بودن (Linearity) و پایداری روش (Robustness)

پس از طراحی و بهینه‌سازی یک روش HPLC برای بررسی پایداری، لازم است آن را اعتبارسنجی (Validation) کنیم تا مطمئن شویم در شرایط واقعی، روش عملکرد قابل اعتماد و دقیقی دارد. طبق الزامات ICH، سه معیار کلیدی که در این مرحله بررسی می‌شوند، عبارت‌اند از ویژگی (Specificity)، خطی‌بودن(Linearity) و پایداری روش (Robustness).

در ادامه به بررسی هر یک از این موارد می‌پردازیم.

ویژگی (Specificity)

این بخش از اعتبارسنجی بررسی می‌کند که آیا روش قادر است API را در حضور سایر ترکیبات مثل محصولات تخریب، ناخالصی‌ها یا مواد جانبی فرمولاسیون (Placebo) بدون تداخل تشخیص دهد یا نه.

• برای این منظور باید نمونه‌هایی شامل API، محصولات تخریب و ترکیبات زمینه‌ای را به‌صورت جداگانه و ترکیبی بررسی کرد.
• روش باید به‌وضوح نشان دهد که پیک مربوط به API با هیچ ترکیب دیگری هم‌زمان نیست.
• استفاده از PDA یا MS برای ارزیابی خلوص پیک در این مرحله بسیار توصیه می‌شود.

خطی بودن (Linearity)

در این آزمون بررسی می‌شود که آیا پاسخ سیستم HPLC نسبت به مقدار ماده‌ی مورد آزمایش، تناسب مستقیم و قابل پیش‌بینی دارد یا نه.

• معمولاً این ارزیابی برای API در بازه‌ی 80 تا 120 درصد مقدار نرمال انجام می‌شود.
• برای محصولات تخریب، گاهی از فاکتور پاسخ نسبی (Relative Response Factor یا به اختصار RRF) استفاده می‌شود، به‌ویژه زمانی که استاندارد خالص برای آن‌ها در دسترس نیست.
• معیار پذیرفته‌شده برای ضریب همبستگی (r²) معمولاً بالاتر از 99.99 است.

پایداری روش (Robustness)

در این بخش بررسی می‌شود که آیا روش نسبت به تغییرات جزئی و ناخواسته در شرایط آزمایش حساس است یا خیر. تغییراتی مثل:

• ±0.2 واحد در pH بافر
• ±10% در دبی (Flow rate)
• ±5 درجه‌ی سانتی‌گراد در دمای ستون
• سپس با استفاده از معیارهایی مثل شکل پیک، رزولوشن، زمان بازداری و تعداد صفحات نظری، ارزیابی می‌شود که آیا روش همچنان عملکرد قابل قبولی دارد یا خیر.

نتیجه‌گیری

یک روش HPLC زمانی قابل اعتماد است که ویژگی مناسبی داشته باشد، پاسخ آن در برابر تغییر غلظت قابل پیش‌بینی باشد و در برابر نوسانات کوچک در شرایط کاری مقاوم باشد. چنین روشی، نه‌تنها نیازهای نظارتی را برآورده می‌کند، بلکه در کاربردهای روزمره‌ی آزمایشگاهی نیز عملکرد پایدار و قابل اتکایی خواهد داشت.