بررسی و حل مشکلات پایایی (Robustness) در HPLC

همان‌طور که ملاحظه می‌کنید، تفکیک، آن‌طور که باید در کروماتوگرام مرجع (پایین) باشد به نظر نمی‌رسد و باید دلیل این موضوع را بررسی کنیم. قله‌ها در ناحیه‌ی مشخص‌شده در تصویر شماره‌ی 1 به گونه‌ای تغییر کرده است که رزولوشن از بین رفته است (تغییر گزینش‌پذیری؟) اما بقیه‌ی تفکیک بسیار مشابه به نظر می‌رسد. برای تغییرات ظریف مانند این مورد می‌توانیم از روش چک‌لیست برای بررسی علت استفاده کنیم.

نخست، مدت زمان ماندگاری (t₀) یا همان hold-up time را بررسی کنید (می‌توانید این کار را با اغتشاش خط مبنای ایجاد‌شده به وسیله‌ی حلال انجام دهید) تا ببینید که آیا هیچ تغییری نسبت به کروماتوگرام مرجع وجود دارد. هرگونه تغییر در t₀ حاکی از آن است که نرخ جریان (یا ابعاد ستون) ممکن است درست یا منطبق نباشد. اصلاح تغییرات در این پارامترها باید آسان باشد و در مثال ما، زمان ماندگاری با مقدار کروماتوگرام مرجع مطابقت دارد. توجه کنید که در هنگام اجرای یک روش روی سیستم‌های مختلف، تغییرات در زمان ماندگاری می‌تواند نشان‌دهنده‌ی تفاوت در حجم اضافی ستون سیستم نیز باشد (V_E).

دمای تفکیک می‌تواند تغییرات ظریفی در گزینش‌پذیری تفکیک ایجاد کند و از آن‌جایی که بررسی این موضوع آسان است، معمولا دومین مورد در فهرست ما است. برای ترکیبات غیرآلی، جابجایی در گزینش‌پذیری یا رزولوشن می‌تواند، بارزتر باشد. تنظیمات دمای ستون را در سیستم داده‌های خود و همچنین دمای واقعی ستون را بررسی کنید (از یک دماسنج دیجیتال ترموکوپل استفاده کنید).

در اینجا اطمینان از صحت عملکرد دستگاه از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. پیشنهاد می‌شود دستگاه خود را به صورت دوره‌ای مورد بازبینی و سرویس قرار دهید. آیا با خدمات تعمیر HPLC شرکت صدراپژوهش آشنایی دارید؟

اگر کروماتوگرام مرجع با سیستم متفاوتی به دست آمده، آن‌گاه باید پروفایل گرادیان را بررسی کرد به ویژه، نسبت به حجم تورم (V_D) دو سیستم. تفاوت در زمان صرف‌شده برای تشکیل و ایجاد تغییر در ترکیب گرادیان می‌تواند با گزینش‌پذیری تفکیک اختلاف ایجاد کند و این معمولا به نوع پمپ و حجم اضافی ستون بستگی دارد.

نکته‌ی اصلی، حصول اطمینان از این موضوع است که گرادیان به درستی برنامه‌ریزی شده است (سیستم داده را بررسی کنید) و هرگونه اختلافی در حجم تورم سیستم در نظر گرفته شده است؛ به ویژه در هنگام انتقال بین سیستم‌های HPLC و UHPLC، قدیمی و جدید، دوتایی یا چهارتایی. در مثال ما سیستم یکسانی به کار رفت. بنابراین چنین مشکلی وجود نداشت. برای آشنایی با تفاوت روش ایزوکراتیک و گرادیان در HPLC کلیک کنید.

جایی که قله‌ها بسیار به هم نزدیکند، تغییرات در شکل قله (جبهه/دنباله) می‌تواند رزولوشن بین زوج قله‌ها را به شدت تغییر دهد. برای این منظور، کنترل دقیق قدرت الوتروپیک، pH و قدرت یونی رقیق‌کننده نمونه برای جلوگیری از مشکلات اعوجاج شکل قله روی مخلوط با شوینده در بالای ستون تجزیه مهم است. زمانی که pH حلال به pKa هر یک از آنالیت‌ها نزدیک باشد یا اگر pH حلال بیش از 1 واحد pH با مقدار pKa بافر اختلاف داشته باشد، تنظیم pH رقیق‌کننده می‌تواند مهم باشد. به طور خلاصه، اگر می‌شود از ترکیب شوینده‌ی اولیه برای رقیق‌کننده استفاده کرد، همین کار را بکنید! تلاش کنید از قدرت یونی پایین‌تر یا قدرت الوتروپیک بالاتر برای رقیق‌کننده‌ی نمونه پرهیز نمایید و بدیهی است که ترکیب رقیق‌کننده باید در هنگام بررسی مشکلات پایایی روش بررسی شود. در مورد ما همه‌چیز در رابطه با رقیق‌کننده‌ی نمونه مناسب بود.

وقتی این بررسی‌های سریع انجام شد، گام بعدی بررسی ترکیب شوینده است و سریع‌ترین راه برای تعیین شوینده به عنوان عامل ایجادکننده، تهیه‌ی دقیق یک دسته‌ی تازه از شوینده یا شوینده‌ها در صورت اجرا در حالت گرادیان است. گزینش‌پذیری یک روش معمولا بیش از همه به واسطه‌ی نوع و غلظت اصلاح‌کننده آلی تحت تاثیر قرار می‌گیرد؛ بنابراین در صورت به‌کارگیری روش ایزوکراتیک، باید بررسی کرد که حلال آلی صحیح به کار رود و نسبت درستی داشته باشد. توجه کنید که برای پرهیز از حجم نادرست به دلیل اثرات گرمای نهان مخلوط، حجم هر حلال باید قبل از ترکیب کردن به طور جداگانه اندازه‌گیری شود.

در صورت وجود آنالیت‌های غیرآلی، pH شوینده می‌تواند تاثیر عمیقی بر گزینش‌پذیری تفکیک داشته باشد. روش تحت بررسی از گرادیانی استفاده کرد که در آن با استفاده از یک سیستم بافر 10mM از آمونیم فرمات با pH تنظیم شده با بکارگیری اسید فرمیک، شوینده روی pH 4.1 تنظیم شده است. اما در هنگام بررسی ترکیب شوینده آبی، pH 4.01 قرائت شد. برخی روش‌ها نسبت به تغییرات اندک در pH بسیار حساسند و بنا بر تجربه، تغییرات ظریف در گزینش‌پذیری تفکیک از قبیل آنچه که اینجا می‌بینیم، اغلب از مقادیر اشتباه pH شوینده نشات می‌گیرد. هر قدر pH شوینده به مقدار pKa آنالیت نزدیک‌تر باشد، بازداری با تغییر pH بیشتر تحت تاثیر قرار خواهد گرفت و در حالی که برای طراحی روش‌هایی تلاش می‌کنیم که در آن از داشتن یک pH شوینده نزدیک به هرگونه مقدار pKa آنالیت پرهیز کنیم، همواره نمی‌توان موفق شد؛ به ویژه در جایی که چند آنالیت غیرآلی وجود دارد که می‌تواند اسیدی، بازی، یون دوقطبی (zwitterionic) یا چندعاملی باشد.

تصویر شماره‌ی 2 یک نمونه مصور را نشان می‌دهد که در آن pH شوینده، تاثیر زیادی بر بازداری و گزینش‌پذیری اسید 2- کلروبنزوییک دارد.

ما معیار pH به کار رفته برای تهیه‌ی شوینده برای تفکیک در تصویر شماره‌ی 1 را بررسی کردیم و دریافتیم که دقیق بوده و به خوبی کالیبره شده است و در نتیجه pH شوینده را مجددا روی 4.1 تنظیم کردیم. پس از متعادل‌سازی مناسب (تقریبا 10 حجم ستون + حجم تورم سیستم)، تفکیک تکرار شد و مشخص گردید که برای مطابقت با کروماتوگرام مرجع اصلی باید اصلاح شود. (برای مشاهده‌ی لیست موجودی و خرید ستون HPLC در صدراپژوهش کلیک کنید.)

در روش ما، تغییر زیادی در گزینش‌پذیری/رزولوشن به واسطه‌ی تغییر بسیار اندک در pH ایجاد شد و این امر نشان می‌دهد که کنترل pH با استفاده از یک pHسنج برای پایش pH در حین افزودن قطره‌ای یک محلول رقیق اسید فرمیک در محلول در حال هم زدن مداوم، ممکن است به اندازه کافی دقیق نباشد. در واقع مشکل این مورد آن بود که اپراتور pH نهایی محلول را در وضعیت ساکن (یعنی بدون هم زدن) اندازه‌گیری نمی‌کرد. در چنین شرایطی، بهتر است شوینده به صورت حجم‌سنجی یا گرانی‌سنجی تولید شود که pH کنترل شده با دقت بیشتری ایجاد خواهد کرد.

وقتی روش‌ها در معرض تغییرات در ترکیب شوینده قرار دارند، تغییر (معمولا کاهش) در قدرت یونی در طی گرادیان ممکن است سبب تغییر در تفکیک شود و برای این منظور گاهی اوقات باید به گرادیان قدرت یونی ثابتی دست یافت. این مورد اغلب با اختلاط اولیه اجزای آبی آلی و بافرشده در نسبت‌های مختلف (معمولا 80:20 و 20:80) و تنظیم نسبت‌های گرادیان حاصل می‌شود.

تصویر شماره‌ی 3 اثرات تغییرات در قدرت یونی روی گزینش‌پذیری ترکیبات خنثی دوقطبی را نشان می‌دهد.

وقتی پایایی روش‌ها چندان مطلوب نیست باید تغییرات در pH شوینده را در طی اجرای فرایند تجزیه کاهش داد. معمولا شوینده‌ها می‌توانند به دلیل ورود CO2 و ماندگاری طولانی اسیدی‌تر شوند و pH نیز می‌تواند به دلیل از دست رفتن اسیدها یا بازهای فرّار تغییر یابد.

تصویر شماره‌ی 4 اولین و آخرین تزریق روش کنونی ما را نشان می‌دهد که تغییرات گزینش‌پذیری/ رزولوشن به دلیل کاهش pH ناشی از ورود CO2 در شوینده را در یک فرایند طولانی تجزیه به نمایش می‌گذارد. با حصول اطمینان از بسته بودن مخازن شوینده می‌توان از این پدیده جلوگیری کرد و در شرایط دشوار، فضای بالاسری در مخزن شوینده را می‌توان با پوششی از نیتروژن جایگزین نمود.

در این مورد، می‌توان افزایش غلظت بافر از 10mM را برای جلوگیری از تغییر pH ناشی از ورود CO₂ در نظر گرفت.

سخن آخر. مطمئن شوید که یک مخلوط تست دارید که انواع تجزیه انجام‌شده در دپارتمان شما را نمایش می‌دهد و می‌توانید به عنوان اندازه‌گیری اضطراری به آن رجوع کنید. بنابراین وقتی همه موارد دیگر تغییر می‌کنند و واقع نمی‌دانید مشکل از کجا ناشی می‌شود، می‌توانید این مخلوط تست را تزریق کنید تا مشکلات دستگاه و ستون HPLC را بررسی نمایید و تکلیف دستگاه را روش کنید.

منبع: وبسایت crawfordscientific